Método para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana predeterminada de una biblioteca de ADN,

caracterizado porque dicho método comprende las etapas de

a) seleccionar la secuencia del identificador de secuencia nº:2

b) preparar una biblioteca de ADN de la secuencia seleccionada en la cual al menos está alterada una posición de aminoácido según la tabla V;

c) cribar en la biblioteca de ADN preparada los polipéptidos que se unen específicamente a una molécula diana predeterminada;

d) seleccionar el ácido nucleico que codifica uno de los elementos con capacidad de unión específica de la etapa c);

e) repetir las etapas b) a d) entre dos y cinco veces; y

f) aislar dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana predeterminada.

Método de identificación de un ácido nucleico que codifica una estructura tipo hemopexina que se une de forma específica a una molécula diana predeterminada La presente invención se refiere a un método para la identificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee propiedades de unión específica a una molécula diana predeterminada que no son inherentes de forma natural a dicho polipéptido. También se describe un proceso para la optimización de la especificidad de unión y un proceso de producción. La invención da a conocer además un método para la identificación y modificación de posiciones de aminoácido alterables dentro de un andamiaje polipeptídico.

Antecedentes técnológicos

En los últimos años, el número de solicitudes de patente y publicaciones relacionadas con reactivos de afinidad ha aumentado de forma constante. La mayoría de las mismas está en relación con anticuerpos, es decir inmunoglobulinas monoclonales o policlonales. Solamente una pequeña parte se refiere a alternativas posibles. Una de estas es la utilización de andamiajes de proteínas. Este concepto requiere una arquitectura proteica estable que tolere múltiples sustituciones o inserciones a nivel de su estructura primaria (Nygren, P-A., Skerra, A., J. Immun. Meth. 290 (2004) 3-28) .

Los andamiajes de proteínas modificados pueden superar los problemas existentes y extender el área de aplicación de los reactivos de afinidad. Un problema entre muchos otros es la aplicación intracelular de anticuerpos. El obstáculo de esta tecnología de bloqueo de proteínas es que no todos los anticuerpos expresados dentro de las células funcionan bien. Este problema se denomina “problema del enlace disulfuro”. Para superar este problema deben realizarse experimentos que requieren mucho tiempo para optimizar un listado complejo de parámetros (Visintin, M., y otros, J. Immun. Meth. 290 (2004) 135-153) .

En este sentido, las proteínas poseen diversas ventajas. Entre ellas están su bajo peso molecular, la facilidad de producción por microorganismos, la simplicidad para ser modificadas y una aplicabilidad amplia. En este contexto se han descrito diversos andamiajes de proteínas, por ejemplo las proteínas dedos de zinc para el reconocimiento del ADN (Segal, D.J., y otros, Biochem. 42 (2003) 2137-2148) ; aptámeros a base de tioredoxina modificados mediante la introducción de secuencias de polipéptidos variables en el bucle del centro activo (Klevenz, B., y otros Cell. Mol. Life Sci. 59 (2002) 1993-1998) ; la proteína A como andamiaje “aficuerpo” (Sandström K y otros, Prot. Eng. 16 (2003) 691-697; Andersson, M., y otros., J. Immun. Meth. 283 (2003) 225-234) ; moléculas ARNm-proteína del décimo dominio de fibronectina de tipo III (Xu, L., y otros, Chem. Biol. 9 (2002) 933-942) o moléculas de unión basadas en el inhibidor de la alfa-amilasa (McConnell, S.J., y Hoess, R.H., J. Mol. Biol. 250 (1995) 460-470) .

Dos criterios caracterizan de forma substancial un andamiaje de proteínas aplicable. En primer lugar, la proteína debe pertenecer a una familia que posea un núcleo hidrofóbico bien definido. Es beneficioso que exista una relación estrecha entre los miembros de la familia (Skerra, A., J. Mol. Recognit. 13 (2000) 167-187) . En segundo lugar, la proteína debe poseer un centro activo o lugar de unión accesible separado espacialmente y funcionalmente independiente. Éste no debe contribuir a la estabilidad intrínseca del núcleo (Predki, P.F., y otros, Nature Struct. Biol. 3 (1996) 54-58) . De forma ideal, esta familia de proteínas está involucrada inherentemente en el reconocimiento de múltiples dianas no relacionadas entre sí.

Tal como se describe en Nygren, P-A., y Skerra, A., J. Immun. Meth. 290 (2004) 3-28 se han utilizado diversos andamiajes de proteínas para el desarrollo de proteínas de afinidad novedosas. Estos andamiajes pueden dividirse en tres grupos: (i) bucles de peptídicos únicos, (ii) interfaces de ingeniería y (iii) bucles hipervariables no contiguos.

Con los andamiajes del primer grupo o bien se diversifican aminoácidos individuales en un bucle expuesto o se insertan secuencias de polipéptidos pequeñas en dicho bucle expuesto (ver por ejemplo, Roberts, B.L., y otros, PNAS 89 (1992) 2429-2433 y Gene 121 (1992) 9-16; Röttgen P., y Collins, J., Gene 164 (1995) 243; Lu, Z., y otros, Bio/Technology 13 (1995) 366-372) . Una desventaja de este enfoque es que es difícil lograr afinidad, si es que se consigue alguna, frente a una diana completamente nueva (Klevenz, B., y otros, Cell. Mol. Life Sci. 59 (2002) 19931998) . Puede modificarse la afinidad de unión intrínseca frente a dianas naturales o dianas altamente relacionadas con éstas, pero difícilmente puede cambiarse la diana o la clase de dianas. Otra desventaja es que en el caso de la inserción de pequeños polipéptidos aleatorizados, debe conocerse la diana y estas secuencias deben generarse previamente sobre la base del conocimiento ya establecido.

Pertenecen a los andamiajes del segundo grupo, por ejemplo, el dominio de unión a inmunoglobulinas de la proteína A estafilocócica (por ejemplo Sandström K., y otros, Prot. Eng. 16 (2003) 691-697) , el dominio de unión a celulosa Cterminal de la celobiohidrolasa I del hongo T. reesei (Smith, G.P., y otros, J. Mol. Biol. 277 (1998) 317-322) y las cristalinas gamma (Fiedler, U., y Rudolph, R., WO 01/04144) .

La tercera clase está representada por las propias inmunoglobulinas y por el escasamente relacionado dominio de fibronectina tipo III, así como algunas clases de neurotoxinas.

Además de la idoneidad como andamiaje para la generación de características de unión específicas para moléculas diana predeterminadas, deben tenerse en cuenta las condiciones de aplicación. Entre otras cosas deben tenerse en cuenta especialmente la estabilidad, la selectividad, la solubilidad y la producción funcional del polipéptido de afinidad. Como ejemplo, ya mencionado anteriormente, el obstáculo de la tecnología de bloqueo de proteínas es que no todos los anticuerpos expresados como moléculas de afinidad dentro de las células se producen de forma funcional (“problema del enlace disulfuro”, Visintin, M., y otros, J. Immun. Meth. 290 (2004) 135-153) .

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es superar estos inconvenientes dando a conocer un andamiaje de polipéptidos alternativo con propiedades de unión específicas frente a una molécula diana predeterminada que no son inherentes de forma natural a dicho polipéptido. Ello comprende la aleatorización de aminoácidos, la optimización de las características de unión y un método de producción del polipéptido optimizado con propiedades de unión específicas.

La patente WO 02/088171 da a conocer métodos para la identificación de dominios de unión con propiedades deseadas mediante el cribado combinatorio de bibliotecas.

Resumen de la invención

La molécula diana predeterminada comprende un miembro de uno de los grupos siguientes: proteínas hedgehog, proteínas morfogénicas óseas, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleuquinas e interferones.

La presente invención da a conocer un método de identificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une de forma específica a una molécula diana de una biblioteca de ADN, comprendiendo dicho método las etapas de a) seleccionar la secuencia del identificador de secuencia nº 2;

b) preparar una biblioteca de ADN de la secuencia seleccionada en la cual se altera al menos una posición de aminoácido según la tabla V;

c) realizar un cribado de la biblioteca de ADN preparada para detectar los polipéptidos codificados que se unen de forma específica a una molécula diana predeterminada;

d) seleccionar el ácido nucleico que codifica un péptido con capacidad de unión específico identificado en la etapa c) ;

e) repetir las etapas b) a d) entre dos y cinco veces; y f) aislar dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une de forma específica a una molécula diana predeterminada.

En otra realización, el método para la identificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une de forma específica a una molécula diana de una biblioteca de ADN, comprende elementos de expresión lineales.

En otra realización, la biblioteca del polipéptido se expresa mediante técnicas de presentación (display) ribosomal.

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1. Método para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana predeterminada de una biblioteca de ADN, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de a) seleccionar la secuencia del identificador de secuencia nº :2 b) preparar una biblioteca de ADN de la secuencia seleccionada en la cual al menos está alterada una posición de aminoácido según la tabla V; c) cribar en la biblioteca de ADN preparada los polipéptidos que se unen específicamente a una molécula diana predeterminada; d) seleccionar el ácido nucleico que codifica uno de los elementos con capacidad de unión específica de la etapa c) ; e) repetir las etapas b) a d) entre dos y cinco veces; y f) aislar dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana predeterminada.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la biblioteca de ADN comprende elementos de expresión lineal.

3. Método, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los miembros de la biblioteca del polipéptido se expresan mediante presentación en ribosomas.

4. Método, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los miembros de la biblioteca del polipéptido se expresan mediante presentación en bacteriófagos.