Método para la generación y el uso de patrones isotópicos estables en datos de espectros de masas.

Composición concebida para el análisis de espectro de masas compuesta por una cantidad determinable por espectrometría de cada uno de (i) al menos un analito a ensayar y (ii) un compuesto estándar,

en el que cada (una de las) molécula(s) del compuesto estándar contiene uno u otro de un par de dos isótopos estables del mismo elemento que difieren en términos de peso molecular en al menos dos unidades de masa atómica uma, estando presentes dichos dos isótopos en las moléculas de dicho compuesto estándar en una relación predeterminada que es distinta de la relación natural de esos isótopos.

Método para la generación y el uso de patrones isotópicos estables en datos de espectros de masas Descripción CAMPO TÉCNICO

La presente solicitud se refiere a la creación y al uso de patrones isotópicos estables en los análisis de espectros de masas. Estos patrones pueden introducirse a través métodos biológicos o no biológicos, o combinaciones de ambos. Más concretamente, un método contemplado utiliza un compuesto con un patrón isotópico estable predefinido y único como estándar. Las relaciones isotópicas no son modificadas por un sistema biológico.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El uso de isótopos estables para determinar la información biológica tiene una larga e ilustre historia [véase, Hellerstein, Metabolic Engineering 6:85-100 (2004) ]. El más antiguo y más frecuente de tales usos se encuentra en los estudios de investigación del metabolismo en los que se incorpora un isótopo estable a una molécula específica en un lugar específico. Esta molécula marcada isotópicamente, o "precursor", se alimenta a un organismo in vivo, sistema celular in vitro o sistema libre de células in vitro durante un periodo de tiempo breve o prolongado, después del cual se determina el destino del isótopo, ya sea mediante el uso de RMN, espectrometría de masas (EM) , degradación química u otra técnica de detección.

A diferencia del uso de isótopos radiactivos, el uso de isótopos estables se considera generalmente seguro y libre de regulación. Aunque, en general, un estudio utiliza por lo general un único isótopo incorporado en un lugar específico con el fin de conseguir una precisión en la comprensión del destino metabólico de una molécula, otra forma de realización del uso de isótopos estables utiliza moléculas marcadas totalmente (> 99% de un átomo está reemplazado con un equivalente isotópico) o marcadas universalmente (el isótopo se distribuye universalmente dentro de la molécula diana por debajo de los niveles de saturación) . Existen muchos estudios conocidos en los que se incorpora más de un isótopo en una molécula diana, y se examinan todos los fragmentos isotópicos para determinar sus destinos diferenciales. En todos los casos, estos métodos son análisis dirigidos; es decir, buscan la incorporación de un átomo marcado específico en otras moléculas específicas.

Otro uso de los compuestos estables marcados isotópicamente es como estándares internos para sus homólogos no marcados, como se describe en EE.UU. 2007 031911. En un uso de este tipo, se añade una molécula isotópicamente enriquecida a una muestra o extracto a una concentración conocida antes del análisis, y la medida final determina la concentración exacta del material no marcado por comparación. En este tipo de estudio, no es raro que un investigador añada más de un estándar isotópicamente distinto si va a cuantificarse más de una molécula.

De hecho, existen formas extremas en las que se prepara una mezcla extremadamente compleja desarrollando un organismo complejo en una materia prima definida isotópicamente de manera que todo el organismo esté compuesto en gran medida, si no completamente, de moléculas que consisten en un único isótopo [Wu et al., Anal Biochem 336:164-171 (2005) ]. En esta situación, se introduce el mismo estándar en todas las muestras, pero el estándar no porta información alguna salvo para fines de cuantificación relativa; es decir, el estándar no tiene ninguna relación con el experimento en cuestión. Históricamente, tales estándares se construyen cuidadosamente para que difieran de cualquier otro analito en una diferencia de masa específica.

En muchas áreas de la ciencia, la necesidad de separaciones cromatográficas reproducibles es fundamental. Sin embargo, el enfoque más común es poner a prueba de forma repetida el equipo antes de procesar la muestra a analizar, porque la variabilidad inherente de los sistemas cromatográficos es un problema desafortunado e irresoluble. Existen soluciones a este problema en las que se añaden o "fijan" compuestos no nativos de la muestra inyectada a concentraciones predeterminadas antes de la inyección, y se utilizan como puntos de referencia en el flujo de eluyente. Estos compuestos se denominan estándares cromatográficos.

En todos estos casos, el tiempo de elución (y, posiblemente, la cuantificación) se corrige (n) a continuación matemáticamente según la posición (y el tamaño) de los picos de los estándares. Cuando se hace esto, el cromatograma no se basa en el "tiempo de retención", sino en el "índice de retención". Esta estrategia funciona bien cuando los estándares pueden identificarse fácilmente y se separan de los demás constituyentes de la muestra, ya sea en tiempo o cualquier otra característica física, tal como la masa.

Lamentablemente, este no suele ser el caso. Si otro compuesto co-eluye de la columna cerca del estándar y comparte cualquier ion común, no puede utilizarse el estándar. Por esta razón, con frecuencia es necesario utilizar varios de tales estándares con el fin de asegurar que podrá utilizarse uno o más de los estándares.

La supresión iónica es un fenómeno que se produce durante los procesos de ionización espectroscópica de masas cuando la eficacia de ionización de la muestra se somete a variabilidad debido a las características de los compuestos analitos que se encuentran presentes. Por lo tanto, en su forma más común, el número de moléculas que podrían ionizarse excede la cantidad de carga disponible. En esta situación, las moléculas que se ionizan con

mayor eficacia son aquellas que pueden adquirir la carga más fuertemente, y las moléculas restantes se ionizan con una eficacia mucho menor.

La presente invención proporciona un método para crear y utilizar patrones de isotopo estable como estándares internos en los análisis de espectros de masas. Por lo tanto, un método contemplado utiliza como estándar un compuesto con una relación predefinida, única y no natural de isótopos estables y por lo tanto proporciona una solución a los problemas del análisis de espectro de masas asociados con la supresión iónica además de proporcionar un estándar más general que puede utilizarse en el ensayo de múltiples tipos de sistemas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En su sentido más amplio, la invención se refiere a la materia objeto tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, la invención contempla una composición que está concebida para el análisis de espectro de masas. La composición está compuesta por una cantidad determinable por espectrometría de cada uno de (i) al menos un analito a analizar y (ii) un compuesto estándar. El analito puede ser una o varias moléculas cualesquiera que puedan analizarse mediante espectro de masas y por lo tanto tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 5.000 unidades de masa atómica (uma) , y preferentemente inferior a aproximadamente 1.000 uma. Cada una de las moléculas del compuesto estándar contiene uno u otro de dos isótopos estables del mismo elemento que difieren en términos de peso molecular en al menos dos unidades de masa atómica. Esos dos isótopos se encuentran presentes en una relación predeterminada que es distinta de la relación natural de esos isótopos. Debido a la presencia de estos isótopos, cada compuesto adquiere un perfil molecular único de dos o más picos que los distingue fácilmente de cualquier compuesto natural.

Otro aspecto de la invención contempla un método para determinar la exactitud de un ensayo espectrográfico de masas de una muestra. El presente método contempla las etapas de proporcionar una muestra para el análisis que comprenda una composición concebida para el análisis de espectro de masas que contiene una cantidad determinable por espectrometría de cada uno de (i) al menos un analito a ensayar y (ii) un compuesto estándar. Cada una de las moléculas del compuesto estándar contiene uno u otro de un par de dos isótopos estables del mismo elemento que difieren en términos de peso molecular en al menos dos unidades de masa atómica. También puede utilizarse más de un par de tales isótopos. Los dos isótopos se encuentran presentes en las moléculas del compuesto estándar en una relación predeterminada que es distinta de la relación natural de esos isótopos. Se lleva a cabo el análisis de espectro de masas de la muestra para proporcionar un conjunto de picos de ion analito, incluidos los picos para los iones producidos por las moléculas de compuesto estándar que contienen los dos isótopos.

Se determina la relación de los dos picos entre sí. Esa relación de picos determinada se compara con la relación predeterminada de los picos presentes en las moléculas... [Seguir leyendo]

1. Composición concebida para el análisis de espectro de masas compuesta por una cantidad determinable por espectrometría de cada uno de (i) al menos un analito a ensayar y (ii) un compuesto estándar, en el que cada (una de las) molécula (s) del compuesto estándar contiene uno u otro de un par de dos isótopos estables del mismo elemento que difieren en términos de peso molecular en al menos dos unidades de masa atómica uma, estando presentes dichos dos isótopos en las moléculas de dicho compuesto estándar en una relación predeterminada que es distinta de la relación natural de esos isótopos.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el par de isótopos estables es Cl-35 y Cl-37, ó O-16 y O-18, o Br-79 y Br-81, o una mezcla de dos o tres de esos pares isotópicos.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho al menos un analito a ensayar tiene un peso molecular de aproximadamente 15.000 uma o menos.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho al menos un analito a ensayar tiene un peso molecular de aproximadamente 5.000 uma o menos.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho al menos un analito a ensayar tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 uma o menos.

6. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene una pluralidad de analitos a ensayar.

7. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene un segundo compuesto estándar, en la que dicho segundo compuesto estándar contiene uno u otro de un segundo par de dos isótopos estables del mismo elemento que difieren en términos de peso molecular en al menos dos unidades de masa atómica, estando presentes dichos dos isótopos en las moléculas de dicho segundo compuesto estándar en una relación predeterminada que es distinta de la relación natural de esos isótopos, siendo diferentes los pesos moleculares de los primeros compuestos estándares de los pesos moleculares de dicho segundo compuesto estándar.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que dichos pares isotópicos primero y segundo son isótopos del mismo elemento.

9. Composición según la reivindicación 7, en la que dichos pares isotópicos primero y segundo son isótopos de un elemento diferente.

10. Método para determinar la exactitud de un ensayo espectrográfico de masas de una muestra que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra para el análisis que comprende una composición concebida para el análisis de espectro de masas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; b) llevar a cabo el análisis de espectro de masas de la muestra para proporcionar un conjunto de picos de ion analito, incluidos los picos para los iones producidos por las moléculas de compuesto estándar que contienen dichos dos isótopos; c) determinar la relación de dichos dos isótopos entre sí; d) comparar la relación isotópica determinada de la etapa c) con la relación predeterminada de dichos isótopos presentes en las moléculas del compuesto estándar antes del análisis de espectro de masas, en el que una relación isotópica determinada en la etapa c) que se encuentre dentro del error experimental de la relación predeterminada indica que los resultados del análisis de espectro de masas de la etapa b) eran correctos, y una relación isotópica determinada en la etapa c) que sea superior al error experimental de la relación predeterminada indica que los resultados del análisis de espectro de masas de la etapa b) eran incorrectos.

Método para determinar la exactitud de una separación cromatográfica de una muestra que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra separada por cromatografía para el análisis que comprende una composición concebida para el análisis de espectro de masas según cualquiera de las reivindicaciones 1-9; b) llevar a cabo el análisis de espectro de masas de la muestra para proporcionar un conjunto de picos de ion analito, incluidos los picos para los iones producidos por las moléculas de compuesto estándar que contienen dichos dos isótopos; c) determinar la relación de dichos dos isótopos entre sí en los picos del compuesto estándar; d) comparar la relación isotópica determinada de la etapa c) con la relación predeterminada de dichos isótopos presentes en las moléculas del compuesto estándar antes del análisis de espectro de masas, en el que una relación isotópica determinada en la etapa c) que se encuentre dentro del error experimental de la relación predeterminada indica que los resultados de la separación cromatográfica eran correctos, y una relación isotópica determinada en la etapa c) que sea superior al error experimental de la relación predeterminada indica

que los resultados de la separación cromatográfica eran incorrectos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho compuesto estándar se mezcla con la muestra separada por cromatografía una vez terminada la separación cromatográfica.