MÉTODO DE DIAGNÓSTICO Y/O PRONÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Método de diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se refiere al uso del complejo heterodimérico de presenilina 1 que comprende los fragmentos N- y C-terminal de la misma como biomarcador de la enfermedad de Alzheimer, así como a un método y a un kit para el diagnostico y/o pronóstico de dicha enfermedad mediante el uso de dicho biomarcador.

La presente invención se encuadra en el campo de la enfermedad de Alzheimer, concretamente dentro de los métodos de diagnóstico y/o pronóstico de este tipo de enfermedad , que se basa en la detección de complejos de presenilina 1 en muestras biológicas aisladas.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza a nivel cerebral por dos estructuras anormales o depósitos proteináceos, las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares. Las placas están compuestas por el péptido ¡3-amiloide (A¡3) , mientras que los ovillos consisten en acúmulos de la proteína tau anormalmente hiperfosforilada (P-tau) . A¡3 y tau I P-tau son biomarcadores reconocidos para la EA y se han investigado extensamente. El análisis en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los niveles de especies de A~1-42 (A~42) Y de tau (niveles totales, T-tau, y formas P-tau) ha demostrado una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la EA (Blennow et al., 2006, Lance!, 368: 387-403) . Sin embargo, existe una continua búsqueda de nuevos biomarcadores en el LCR para su uso en apoyo del diagnóstico clínico, especialmente para las etapas iniciales de la EA, así como para su uso en ensayos clínicos.

El contar con un diagnóstico temprano y preciso de la EA es esencial en el avance del tratamiento de esta demencia. Numerosos laboratorios han reportado incrementos en los niveles de T-tau y P-tau en el LCR, pero estos marcadores también aumentan en otros procesos que cursan con demencia, luego hay una falta de especificidad.

Respecto al otro marcador clásico de la EA, el A¡3, 42, su generación se incrementa en el cerebro EA, sin embargo, y debido a la deposición creciente del péptido, se da la paradoja de que sus niveles en LCR se reducen (Blennow et al., 2010, Nat Rev Neurol., 6: 131-144) .

Estos biomarcadores clásicos han mostrado valor en el diagnóstico de EA a nivel temprano, pero la necesidad de identificar otros marcadores bioquimicos especificos que permitan refinar el diagnóstico persiste. Además, en el campo de los biomarcadores de la EA uno de los mayores déficits es el seguimiento de terapias.

A fecha de hoy se conocen la mayoría de las proteínas implicadas en el procesamiento patológico de la proteína precursora de amiloide (APP) , procesamiento que genera el péptido j3-amiloide. El Aj3 es generado a través de la acción sucesiva de dos enzimas que actúan sobre el APP, las enzimas j3-secretasa y y-secretasa (Thinakaran y Koo, 2008, J Biol Chem., 283:29615-29619) .

La actividad j3-secretasa se debe fundamentalmente a una proteína denominada BACE1 (de ~beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 ~; Vassar et al., 2009, J Neurosci. , 29: 12787-12794) . BACE1 está presente en el LCR como una forma truncada soluble (Holsinger el al., 2004; Ann. Neurol., 55: 898-899) . Como BACE1 contiene un único dominio transmembrana, su presencia en el LCR no fue sorprendente y se caracterizó ya hace casi una década. En este contexto, se ha propuesto que un aumento de los niveles de BACE1 en el LCR de EA reflejaría la elevación de los niveles de proteína y actividad BACE1 en el cerebro patológico; aunque no existe consenso sobre si esta enzima estaría igualmente afectada en distintos estadios de la enfermedad (Rosen el al., 2012, Neuromolecular Med., 14: 65

73) .

En contraste, la actividad y-secretasa se debe a un complejo formado por cuatro subunidades: la presenilina-1 (PS1) (o presenilina-2) , la nicastrina, APH-1 (~anterior phar y nx-defective 1") y la PEN-2 (Upresenilin enhancer 2") . Presenilina-1 (PS1) es la subunidad catalítica del complejo, es una aspartil proteasa con nueve dominios de transmembrana.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención propone el uso del complejo heterodimérico que comprende los fragmentos C-terminal (CTF) y N-terminal (NTF) de presenilina 1 para el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) , y por tanto proporciona un método alternativo de diagnóstico y/o pronóstico de la EA basado en el uso de dicho complejo heterodimérico.

Presenilina-1 (PS1) es el componente activo del complejo y-secretasa encargado del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del ¡3-amiloide o APP, generandose el péptido AB cuya expresión anómala es uno de los desencadenantes de la enfermedad de Alzheimer. PS1 es una proteína transmembrana que contiene múltiples regiones hidrófobas, por lo que su presencia en el líquido cefalorraquídeo (LCR) no se ha medido hasta la fecha.

La maduración de la PS1 a su forma activa conlleva una escisión endoproteolítica que escinde la proteína en dos partes o fragmentos N-y C-terminales. De este modo al extraer la enzima de cerebro o células en cultivo en presencia de detergentes, sólo una pequeña proporción de PS1 se extrae como su forma entera.

Los inventores de la presente invención han detectado que la PS1 esta presente en el LCR humano como hetero-complejos de aproximadamente 100 -150 kDa de masa molecular compuestos por los fragmentos C-terminal y N-terminal de dicha proteína. Asimismo, han demostrado que el nivel de estabilidad de dichos complejos es significativamente más elevado en el LCR de pacientes que padecen EA frente a sujetos cognitivamente normales.

Así, la presente invención supone una solución a la necesidad de aportar un método alternativo de diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer, detectable en una muestra biológica.

Ademas, el método descrito en la presente invención aporta la ventaja de que permite llevar a cabo un diagnóstico y/o pronóstico de la EA útil en el seguimiento de terapias para dicha enfermedad. El potencial de que secretasas sean dianas de nuevos tratamientos de EA hace particularmente interesante que la detección de la estabilidad de los complejos heterodiméricos de PS 1, como se propone en la presente invención, represente un biomarcador en ensayos clinicos, en la monitorización del tratamiento y la progresión de la enfermedad , donde el uso de los actuales biomarcadores es más discutido.

Por ello, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso del complejo heterodimérico que comprende los fragmentos e-terminal y N-terminal de PS1 para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA.

Se entiende por "complejo heterodimérico~ un complejo que está formado por dos subunidades proteicas distintas. En la presente invención el complejo heterodimérico lo componen los monómeros del fragmento N-terminal y del fragmento C-terminal de la proteína PS1 .

La "presenilina 1~ o "PS1~ , como se ha explicado anteriormente, es el componente activo o subunidad catalítica del complejo y-secretasa encargado del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del ¡3-amiloide o APP, generándose el péptido A¡3 cuya expresión anómala es uno de los desencadenantes de la EA. PS1 es una aspartil proteasa con nueve dominios transmembrana que contiene múltiples regiones hidrófobas. Preferiblemente, la PS1 a la que se refiere la presente invención es la proteína de SEO ID NO: 1 o referencia P49768.1 en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot. El fragmento N-terminal o NTF de PS1 es el fragmento comprendido entre los residuos aminoacídicos 1 a 298 de la SEO ID NO: 1. El fragmento C-terminal o CTF de PS1 es el fragmento comprendido entre los residuos aminoacidicos 299 a 467 de la SEQ ID NO: 1.

El término "enfermedad de Alzheimer" o "EA~, tal y como se emplea en la presente invención, se refiere a una enfermedad neurodegenerativa que se manifiesta como deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma tipica por una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales, a medida que las células nerviosas degeneran y/o mueren y diferentes zonas del cerebro se atrofian.

Se entiende por "diagnóstico~ el procedimiento mediante el cual se identifica la presencia o ausencia de EA en un sujeto. El término upronóstico~ se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de la EA, incluyendo aumento de la gravedad de la enfermedad y la capacidad de respuesta a un determinado tratamiento en un sujeto enfermo que padece EA.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de la EA, de ahora en adelante ~método de la invención", que comprende las siguientes etapas:

a) detectar los complejos heterodiméricos de presenilina 1 que comprenden los fragmentos C-terminal y N-terminal de la misma en una muestra biológica aislada de un sujeto,

b) determinar la estabilidad de los complejos detectados en el paso (a) ,

c)...

1. Uso del complejo heterodimérico que comprende los fragmentos e-terminal y Nterminal de presenilina 1 para el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer.

2. Método para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer que comprende las siguientes etapas:

a) detectar los complejos heterodiméricos de presenilina 1 que comprenden los fragmentos e-terminal y N-terminal de la misma en una muestra biológica aislada de un sujeto,

b) determinar la estabilidad de los complejos detectados en el paso (a) , e) comparar el valor obtenido en la etapa (b) con un valor control, y d) asignar al sujeto del paso (a) al grupo de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer o al grupo de pacientes con un mal pronóstico de la enfermedad de Alzheimer cuando el valor obtenido en la etapa (b) es significativamente mayor que el valor control.

3. El método según la reivindicación 2, donde el valor control es el valor de la estabilidad del complejo heterodimérico que comprende los fragmentos e-terminal y Nterminal de presenilina 1 en una muestra biológica aislada de un sujeto sano.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, donde la muestra biológica aislada es liquido cefalorraquideo.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la muestra biológica aislada es liquido cefalorraquideo lumbar.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la muestra biológica aislada es liquido cefalorraquídeo ventricular.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde la detección de la etapa (a) se lleva a cabo mediante Western blot.

8. El método según la reivindicación 7, donde la muestra biológica aislada se procesa en presencia de SOS, y a una temperatura no superior a 50º C para su análisis por Western blot.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde la determinación de la estabilidad de los complejos en la etapa (b) se lleva a cabo mediante un primer paso de ultracentrifugación en gradiente de sacarosa en presencia de detergentes y un segundo paso de Western blot.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde el sujeto es un humano.

11. El método según la reivindicación 10, donde el humano está siendo sometido a un tratamiento terapéutico frente a la enfermedad de Alzheimer.

12. Un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer que comprende anticuerpos para la detección del complejo heterodimérico que comprende los fragmentos e-terminal y N-terminal de presenilina 1.

13. El kit según la reivindicación 12 que comprende un anticuerpo específico frente al fragmento e-terminal de presenilina 1 y un anticuerpo específico frente al fragmento Nterminal de presenilina 1.

14. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 que además comprende detergentes, agentes reductores, agentes desnaturalizantes y/o compuestos reguladores del pH.

15. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.