Método de diagnóstico de la enfermedad de Farber.

La presente invención se refiere a una familia de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean dichos compuestos unidos a un fluoróforo,

cromóforo o luminóforo como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Además la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos uno de estos compuestos para utilizar en el diagnóstico de la enfermedad a partir de una muestra biológica aislada de un individuo.

Método de diagnóstico de la enfermedad de Farber.

La presente invención se refiere a una familia de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean dichos compuestos unidos a un fluoróforo, cromóforo o luminóforo como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Por tanto la presente invención se engloba dentro de la química y más específicamente de la química aplicada al diagnóstico de enfermedades y la determinación de actividades enzimáticas.

Estado de la técnica anterior

La enfermedad de Farber, también llamada lipogranulomatosis, es un desorden hereditario de almacenamiento de lípidos caracterizado por una acumulación de ceramidas en los lisosomas, debido a una carencia de la actividad enzimática que la degrada, la ceramidasa ácida. Esta enfermedad presenta una tríada de síntomas comunes: inflamación de las articulaciones, nódulos subcutáneos y ronquera. Algunas veces pueden aparecer hepatoesplenomegalia y malfuncionamiento del sistema nervioso. Se trata de una enfermedad muy grave en la que los pacientes mueren generalmente antes de los dos años de edad (Levade T, Sandhoff K, Schulze H, Medin JA. Acid ceramidase deficiency: Farber lipogranulomatosis (2009) in D. Valle et al. (eds): Scriver's OMMBID (Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease), New York, McGraw-Hill).

Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad de Farber se realiza básicamente por tres tipos de métodos:

i) Determinación de la actividad ceramidasa ácida. Esto se ha realizado principalmente utilizando N-oleoil o N-lauroil esfingosinas marcadas radioactivamente sobre homogeneizados celulares. Estos sustratos se caracterizan por ser muy poco solubles y los ensayos deben realizarse en el seno de mezclas complejas de detergentes. Además, la separación y cuantificación de productos suponen un proceso largo y tedioso: extracción de lípidos, migración por cromatografía de capa fina (CCF), lectura de las placas en un radiochromatoscanner para la identificación de los productos y posterior separación de la sílice del soporte y cuantificación por centelleo líquido. Otro inconveniente de estos ensayos es que estas ceramidas pueden ser degradadas por otras ceramidasas no lisosomales, que no son deficientes en la enfermedad de Farber.

ii) Loading tests o tests de carga. Estos consisten en la adición directa de esfingolípidos marcados radioactivamente al medio de cultivo celular, para el posterior análisis de su metabolismo. Las moléculas utilizadas en estos tests han sido la ceramida, el cerebrósido sulfato y la esfingomielina. Esta última ha demostrado ser la más adecuada para este fin puesto que las otras moléculas son metabolizadas parcialmente o casi totalmente por enzimas no lisosomales, mientras que la esfingomielina se dirige principalmente al lisosoma. Así pues, en este compartimento la esfingomielina es degradada a ceramida y mediante el estudio de los perfiles lipídicos se puede observar una potencial acumulación de este lípido en células de enfermos de Farber. El análisis de estos perfiles requiere el mismo proceso de separación y cuantificación que el método anterior, pero este test presenta la ventaja de necesitar menos cantidad de material biológico. Los inconvenientes de estos test son que estas moléculas radioactivas no están disponibles comercialmente y que las moléculas pueden ser degradadas parcialmente por enzimas no lisosomales.

iii) Cuantificación de los niveles de ceramida. Estos métodos tienen como objetivo medir la acumulación de ceramida que se produce en los lisosomas de las células de enfermos de Farber. Algunos autores han utilizado la derivatización de la ceramida, presente en fluidos corporales o tejidos, para dar lugar a moléculas que pueden ser detectadas, separadas y cuantificadas por cromatografía líquida (HPLC) o de gases (GCL) acoplada a detector de masas (MS). Otro método conocido para medir el almacenamiento de ceramida utiliza el enzima diacilglicerol quinasa (DAGk). Este enzima, además de fosforilar el diacilglicerol, tiene una gran afinidad por la ceramida. Aprovechando esto, la ceramida presente en el extracto lipídico se hace reaccionar con la DAGk en presencia de [³²P]-γ-ATP, para dar lugar a ceramida-1-fosfato. La fase orgánica de esta reacción se hace migrar por CCF y la placa se expone a una película fotográfica o directamente se visualiza en un escáner que detecta el [³²P]. La ceram ida-1-fosfato producida refleja la cantidad de ceramida acumulada en los lisosomas de las células. La ventaja de este método es que tanto el ATP radioactivo como el enzima están disponibles comercialmente, pero el ensayo es largo y laborioso.

Así pues, los métodos existentes para el diagnóstico de la enfermedad de Farber utilizan en su mayoría moléculas radioactivas y tienen en común la complejidad de la extracción y separación de lípidos para su análisis, ya sea por CCF, HPLC o GLC. Todas estas desventajas hacen que el diagnóstico de la enfermedad de Farber esté reservado a un número limitado de laboratorios especializados.

Descripción de la invención

La presente invención describe una serie de compuestos y un método para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber que está basado en la hidrólisis enzimática de estos compuestos que son sustrato de la enzima ceramidasa ácida, enzima implicada en las disfunciones que provocan los síntomas de dicha enfermedad.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I)

donde

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₄, alquenilo C₂-C₂₄, alquinilo C₂-C₂₄ o un grupo -R₂-Y-R₃, donde

Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O₂), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O),

R₂, se selecciona entre alquilo C₁-C_a, alquenilo C₂-C_a, alquinilo C₂-C_a,

R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C_b, alquenilo C₂-C_b, alquinilo C₂-C_b, siendo a+b≤q24,

m es un valor entre 1 y 10,

X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,

con la condición de que cuando X es umbeliferona y m es 2, R₁ es distinto de -(CH₂)₁₄CH₃.

El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 10 a 12, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, decilo, dodeciloetc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonil, amino, nitro, mercapto y alquiltio.

El término "alquenilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1,3-butadienilo etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.

El término "alquinilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace simple por ejemplo, etinilo, 1-propinilo, etc. El grupo alquinilo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.

"Fluoróforo" se refiere a un grupo químico de pequeño tamaño que forma... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula

donde

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₄, alquenilo C₂-C₂₄, alquinilo C₂-C₂₄ o un grupo -R₂-Y-R₃, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O₂), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R₂, se selecciona entre alquilo C₁-C_a, alquenilo C₂-C_a, alquinilo C₂-C_a, R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C_b, alquenilo C₂-C_b, alquinilo C₂-C_b, siendo a+b≤q24,

m es un valor entre 1 y 10,

X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,

con la condición de que cuando X es umbeliferona y m es 2, R₁ es distinto de -(CH₂)₁₄CH₃.

2. Compuesto según la reivindicación 1 donde m es un valor entre 2 y 4.

3. Compuesto según la reivindicación 2 donde m es 2.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde R₁ es un alquilo -(CH₂)_nCH₃, donde n es un valor entre 1 y 24.

5. Compuesto según la reivindicación 4 donde n es 10.

6. Compuesto según las reivindicaciones anteriores donde X es umbeliferona.

7. Método de diagnóstico para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber que comprende:

a) Obtención de una muestra biológica aislada de un individuo

b) adición de un compuesto de fórmula (I):

donde

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₄, alquenilo C₂-C₂₄, alquinilo C₂-C₂₄ o un grupo -R₂-Y-R₃, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O₂), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R₂, se selecciona entre alquilo C₁-C_a, alquenilo C₂-C_a, alquinilo C₂-C_a, R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C_b, alquenilo C₂-C_b, alquinilo C₂-C_b, siendo a+b≤q24,

m es un valor entre 1 y 10,

X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo

a una muestra biológica aislada de un individuo,

c) incubación de la mezcla obtenida en (b)

d) oxidación de la mezcla obtenida en (c)

e) detección de la fluorescencia producida en la mezcla obtenida en (d).

8. Método según la reivindicación 7 donde m es un valor entre 2 y 4.

9. Método según la reivindicación 8 donde m es 2.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde R₁ es un alquilo -(CH₂)_nCH₃, donde n es un valor entre 1 y 24.

11. Método según la reivindicación 10 donde n es 10.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde X es umbeliferona.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es un fluido corporal.

14. Método según la reivindicación 13 donde el fluido corporal es sangre.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es tejido epitelial.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 donde el tiempo de incubación en el paso (b) es entre 0,5 y 5 horas.

17. Uso de un compuesto de fórmula (I):

donde

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₄, alquenilo C₂-C₂₄, alquinilo C₂-C₂₄ o un grupo -R₂-Y-R₃, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O₂), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R₂, se selecciona entre alquilo C₁-C_a, alquenilo C₂-C_a, alquinilo C₂-C_a, R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C_b, alquenilo C₂-C_b, alquinilo C₂-C_b, siendo a+b≤q24,

m es un valor entre 1 y 10,

X es fluoróforo, cromóforo o luminóforo,

para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo.

18. Uso según la reivindicación 17 donde m es un valor entre 2 y 4.

19. Uso según la reivindicación 18 donde m es 2.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 donde R₁ es un alquilo -(CH₂)_nCH₃, donde n es un valor entre 1 y 24.

21. Uso según la reivindicación 20 donde n es 10.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 donde X es umbeliferona.

23. Un kit útil para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber a partir de una muestra aislada de dicho individuo, que comprende el compuesto de fórmula (I).

24. Uso de un kit según la reivindicación 23 para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo.