Método para diagnosticar cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas.

Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2 definida por SEQ ID NO:

1, estando dicho epítopo definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es adecuado para distinguir la proteína de SEQ ID NO: 1 del receptor HER2.

Método para diagnosticar cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas La presente invención se refiere a un método de diagnóstico en muestras aisladas de cánceres que expresan el receptor HER2. La invención también proporciona compuestos para su uso en el diagnóstico y la identificación tempranos del cáncer así como para su uso en terapia.

Técnica anterior

HER2 (también conocido como c-erbB2, ErbB2 o Neu) es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico o EGFR, también conocida como HER1 o ErbB1. Dos miembros adicionales, HER3 y HER4 completan esta familia. Cuando HER1, 3 ó 4 se une a un ligando de tipo EGF, su dominio extracelular adopta la conformación denominada “abierta”, que permite la formación de homodímeros y heterodímeros. Aunque no se una a ningún ligando, HER2 también interacciona con otros receptores HER unidos a un ligando, debido al hecho de que su dominio extracelular es de conformación constitutivamente “abierta”.

La dimerización dirigida por el dominio extracelular conduce a la interacción de la cinasa intracelular de los receptores HER y a la posterior transfosforilación de algunos residuos de tirosina. Estas fosfotirosinas actúan como acopladores de un grupo de proteínas de unión a fosfotirosina intracelular. Las interacciones establecidas en la membrana plasmática se transducen al núcleo celular por medio de diferentes rutas de señalización, tales como la ruta de la proteína cinasa activada por proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) , la ruta de la proteína cinasa activada por estrés (JNK) , fosfolipasa C gamma, etc. Todos estos circuitos de señalización controlan la expresión de genes que actúan de manera coordinada para modificar aspectos determinantes del estado de la célula, tales como proliferación, migración, supervivencia y adhesión celular. Por tanto, dependiendo del contexto celular, la activación de los receptores HER da como resultado una respuesta celular drástica, que puede oscilar entre la transformación en una célula maligna y una senescencia prematura.

Además del modo de señalización canónico, los receptores HER o fragmentos de los mismos pueden endocitarse y transportarse al núcleo, donde pueden regular directamente la expresión de determinados genes. Este hecho se ha observado para el caso específico de HER2 (Wang et al., “Binding at and transactivation of the COX-2 promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2”, Cancer Cell-2004, Vol. 6, págs. 251-261) , así como para un fragmento carboxilo terminal (CTF) , que consiste en una forma truncada del receptor HER4, que incluye toda la parte citoplasmática (Linggi et al., “ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates ETO2-dependent transcriptional repression”,

J. Biological Chemistr y -2006, Vol. 281, págs. 25373-25380) .

En tumores de mama humanos, se ha encontrado a menudo una serie de fragmentos carboxilo terminales o CTF, que se supone que incluyen los dominios transmembrana y citoplasmático de HER2 (Molina et al, “NH (2) -terminal truncated HER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metastasis in human breast cancer”, Clinical Cancer Research-2002, Vol. 8, págs. 347-353) . También se sabe que pacientes con cáncer de mama que expresan los CTF de HER2, o lo que viene a ser lo mismo, formas truncadas que no incluyen el extremo N-terminal de HER2 (CTF de HER2) , tienen una mayor probabilidad de desarrollar metástasis (Molina et al. 2002, citado anteriormente) y un pronóstico peor que aquellas pacientes que expresan principalmente la forma completa de HER2 (Saez et al., “p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cancer”, Clinical Cancer Research-2006, Vol. 12, págs. 424-431) .

Por tanto, es muy importante poder detectar la presencia de HER2 en tumores a tiempo e incluso más importante determinar si está en una forma completa o truncada (CTF) .

Actualmente, a nivel de las pruebas clínicas de rutina se usan anticuerpos para detectar la presencia de la forma completa de HER2, con el fin de determinar el tipo de tumor de mama en cuestión. En el caso de detectar la presencia de HER2, la terapia recomendada consiste en administrar anticuerpos monoclonales terapéuticos, tales como trastuzumab de Genentech. El uso de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer se describe en la solicitud WO 8906692 a nombre de Genentech. El documento WO 8906692 describe anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la región extracelular de HER2, correspondiendo esta región extracelular con la parte externa completa de la proteína, que es su extremo N-terminal. Tal como se mencionó anteriormente, los epítopos reconocidos por los anticuerpos citados en el documento WO 8906692 son regiones antigénicas del dominio extracelular de la forma completa de HER2 y no se incluyen en las formas truncadas o fragmentos carboxilo terminales de HER2. Por tanto, con los anticuerpos y el método de diagnóstico descrito en el documento WO 8906692 no será posible detectar la presencia de HER2 truncado (CTF) . Además, en los tumores de mama en los que se expresan dichos CTF de HER2, los anticuerpos tales como trastuzumab no son terapéuticos, ya que no reconocen ningún epítopo. Este hecho explica la resistencia al tratamiento con trastuzumab observada en pacientes que expresan formas truncadas (CTF) de HER2.

Las pacientes que expresan formas truncadas o CTF de HER2 deben tratarse con terapias alternativas con el fin de evitar los números de mal pronóstico observados por Saez et al 2006 (citado anteriormente) . Con el fin de detectar

(diagnosticar) y tratar lo antes posible personas que tienen tumores en los que se expresan formas truncadas de HER2, es muy interesante poder distinguir qué forma de HER2 se expresa con el fin de actuar en consecuencia.

El documento de Anido et al., “Biosynthesis of tumorigenic HER2 C-terminal fragments by alternative initiation of translation”, European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal -2006, Vol. 25, págs. 3234-3244, describe que además del fragmento generado por la acción de las alfa-secretasas en el HER2, que da lugar a una forma truncada (CTF) conocida como P95 que incluye el fragmento transmembrana y citoplasmático del receptor, también se generan dos formas truncadas (CTF) a través de un mecanismo de inicio alternativo de la traducción que comienza a partir de dos metioninas ubicadas en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’, respectivamente, del dominio transmembrana de HER2. Específicamente, las metioninas para el inicio alternativo de la traducción corresponden a la metionina 611 y la metionina 687 de la secuencia de aminoácidos con número de registro M11730.1 de la base de datos UniGene del National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Este documento también muestra que estas formas alternativas del receptor HER2 (CTF) están presentes en tumores de mama. En particular, indica que las más abundantes corresponden a la forma conocida como CTF687, o en otras palabras, a la proteína obtenida mediante el inicio alternativo de la traducción que comienza a partir de la metionina en la posición 687. Anido et al. proponen como terapia el uso de inhibidores de la actividad tirosina cinasa de HER2, tales como lapatinib, con el fin de minimizar el crecimiento de los tumores que expresan estas formas truncadas de HER2. Los inhibidores de las tirosina cinasas actúan mediante la interacción con el extremo C-terminal del receptor HER2 que está presente de manera integral tanto en el receptor completo como en los CTF derivados del mismo o producidos mediante el inicio alternativo de la traducción.

El documento de Scaltriti et al, “Expression of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and response to anti-HER2 therapies in breast cancer”, Journal of National Cancer Institute-2007, Vol. 99, págs. 628-368, representa un ejemplo de un estudio dando lugar a una metodología alternativa para detectar la presencia de una de las formas truncadas del receptor HER2 y enumera algunas de las posibles causas de resistencia al tratamiento con trastuzumab (Herceptin) . En particular, hace hincapié en la acumulación del fragmento p95HER2 (producto de la proteólisis de HER2 mediante alfa-secretasas) y otras formas truncadas del receptor, que no tienen el dominio extracelular reconocido por Trastuzumab. Scaltriti propone un método de inmunofluorescencia para detectar el fragmento p95HER2 (producto de proteólisis mediante alfa-secretasas) . Este nuevo método de detección puede llevarse a cabo en cortes de tejido embebidos en parafina y fijados con formalina... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2 definida por SEQ ID NO: 1, estando dicho epítopo definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es adecuado para distinguir la proteína de SEQ ID NO: 1 del receptor HER2.

2. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo es uno incluido en SEQ ID NO: 3.

3. Anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es adecuado para distinguir la proteína de SEQ ID NO: 1 de la forma truncada 648CTF/p95 del receptor HER2.

4. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 2 ó 3, en el que la distinción puede visualizarse mediante una o más de inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunohistoquímica en células cultivadas e inmunohistoquímica en muestras de pacientes.

5. Anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo policlonal.

6. Anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.

7. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 6, producido por la línea celular de hibridoma depositada en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen -DSMZ” con número de registro DSM ACC2904 o la línea celular de hibridoma depositada en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen -DSMZ” con número de registro DSM ACC2980.

8. Anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el fragmento es uno seleccionado del grupo formado por F (ab) , F (ab’) y Fv.

9. Hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6 ó 7.

10. Péptido que consiste en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, que está opcionalmente conjugado con un inmunógeno, para su uso en un método para producir un anticuerpo según una o más de las reivindicaciones 1 ó 2, método que implica la inmunización con dicho péptido.

11. Método para obtener un anticuerpo monoclonal, en el que la línea celular de hibridoma según la reivindicación 9 se hace crecer en un medio de cultivo adecuado y el anticuerpo monoclonal se recupera de este medio.

12. Método de diagnóstico de cáncer, que comprende la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 en una muestra de paciente, en

el que la detección se lleva a cabo con medios seleccionados independientemente del grupo que comprende:

(i) detección a través de migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1, en relación con una forma completa de dicho receptor HER2; y

(ii) detección mediante la unión con uno o más anticuerpos según una o más de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Método según la reivindicación 12, que es un método de pronóstico que permite el pronóstico de la 55 evolución del crecimiento tumoral y/o metástasis.

14. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2.

15. Agente para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

16. Agente para el diagnóstico según la reivindicación 15, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se dispone sobre un soporte sólido.

17. Kit para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para detectar la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 en la muestra.

18. Kit para el diagnóstico y la determinación del pronóstico según la reivindicación 17, en el que los medios de detección comprenden al menos un agente según las reivindicaciones 15 ó 16.

19. Kit para el diagnóstico y la determinación del pronóstico según la reivindicación 17, en el que los medios de detección consisten en la detección mediante migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 de SEQ ID NO: 1, en relación con la forma completa de dicho receptor HER2.

20. Anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, para uso terapéutico. 15

21. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 20, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO:

1.

22. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 21, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos, incluyendo seres humanos.

23. Anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones 21, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres seleccionados del grupo que comprende cáncer de pulmón, páncreas, colon,

estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salival, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, trompas de Falopio, tumores de Wilms, así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma sinovial, meduloblastomas, tumores trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemomas, neuromas, rabdomiosarcomas.

24. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en el que al menos se expresa la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1.

25. Composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres en la que al menos se expresa la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1, caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.