Método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1.

Método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de cilicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1.

La presente invención se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y al uso de un kit para llevar a cabo dichos métodos.

Método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1.

La presente invención se enmarca dentro del campo de la neurobiología y de la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y al uso de un kit para llevar a cabo dichos métodos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo, de origen todavía desconocido. Dicha enfermedad es la causa de invalidez y dependencia más frecuente en la actualidad, entre las personas de edad avanzada. Se estima que 8 millones de europeos están afectados por la enfermedad de Alzheimer y, teniendo en cuenta el envejecimiento de la población, se prevé que el número de enfermos se duplique en 2020 y triplique en 2050. Pese a estos datos, todavía no existen tratamientos capaces de curar la enfermedad y, la no existencia de marcadores bioquímicos capaces de distinguir a la EA de otro tipo de demencias, hace que el diagnóstico de la misma no sea del todo concluyente.

Esta enfermedad está caracterizada por una progresiva pérdida de memoria y de otras capacidades mentales a medida que las neuronas degeneran y diferentes zonas del cerebro se atrofian. A nivel neuropatológico la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la aparición de dos estructuras anormales que se acumulan en el cerebro, los depósitos amiloides (fibras insolubles localizadas extracelularmente formadas por el péptido º-amiloide (ºA) ) y los ovillos neurofibrilares (conglomerados de la proteína citoesquelética tau hiperfosforilada) . Por otro lado, también se ha descrito glicosilación alterada para diversas glicoproteínas tanto en el líquido cefalorraquídeo (LCR) como en el cerebro de pacientes con EA (Sáez-Valero et al., Lancet 1997, 350, 929; Guevara J et al., Exp. Neurol. 1998, 57, 905-914; Fodero LR. et al., J. Neurochem. 2001, 79, 1022-1026; Kanninen K et al., Neurosci Lett. 2004, 367, 235-240; Botella-López A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578) , por lo que se piensa que las alteraciones patológicas que acontecen en el cerebro de Alzheimer pueden ser consecuencia o determinante de cambios en la pauta de glicosilación.

Las glicoproteínas consisten en una mezcla de variantes glicosiladas, denominadas glicoformas, en las que la misma secuencia peptídica está asociada a la unión de uno o más oligosacáridos al mismo punto de glicosilación. En una misma especie, los restos oligosacarídicos dependen del tipo celular y su equipamiento enzimático, pero también de su estado de desarrollo, nutricional y patológico. Una misma proteína puede presentar incluso en el mismo tipo celular alternativas en su glicosilación que marquen diferentes localizaciones subcelulares (o secreción) y determinen su función y funcionalidad.

Un glicoepítopo (porción glucídica de una glicoproteína) abundante en el sistema nervioso central es el llamado HNK-1, un carbohidrato inusual que contiene el azúcar ácido 3-sulfo-glucurónico en la siguiente secuencia: GlcA (3-sulfato) (º1º3) Gal (º1º4) GlcNAc (Voshol H et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 2295722960) . El glicano HNK-1 es un marcador de adhesión celular, presente en glicolípidos (SGGL-1 y SGGL2) y glicoproteínas.

La expresión del glicoepítopo HNK-1 está temporalmente y espacialmente regulada durante el desarrollo. Y lo que resulta potencialmente más interesante, el determinante HNK-1 sólo aparece en algunas variantes (glicoformas) de la misma proteína y sólo en determinados tejidos, posiblemente revelando funciones fisiológicas distintas para dichas variantes. Así, podemos suponer que dicho azúcar determina y participa en las funciones y/o localización específica de unas variantes de glicoproteínas frente a otras, variantes que pueden estar específicamente afectadas en ciertas condiciones patológicas; aunque hasta el momento no es conocido como se regula el glicoepítopo HNK-1 durante la patogénesis neurodegenerativa en general y en la EA en particular.

Por tanto, aunque el hallazgo de patrones específicos de expresión de determinadas glicoproteínas y su identificación en el LCR o plasma, podría ser de gran interés como marcador biológico, aún no se han encontrado marcadores bioquímicos que diferencien la EA de otro tipo de demencias, por lo que persiste el problema del diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y a un kit para llevar a cabo dichos métodos.

Es de destacar que la presente invención demuestra que el glicoepítopo HNK-1, asociado a diversas proteínas, presenta manifiesta alteración en la inmunoreactividad (cantidad relativa) de las bandas HNK-1 detectadas en cerebro de Alzheimer al comparar éstos con controles no patológicos, indicando que la patología afecta específicamente a glicoformas asociadas con el epítopo HNK-1 en el cerebro de Alzheimer.

Debido a que la expresión de proteínas portadoras del epítopo HNK-1 se muestra específicamente afectada en la enfermedad de Alzheimer, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para determinar la enfermedad de Alzheimer y más específicamente, para determinar la presencia o ausencia de dicha enfermedad neurodegenerativa basado en la determinación de glicoproteínas asociadas con el epítopo HNK-1.

Por tanto, la presente invención resuelve el problema técnico que plantea el diagnóstico de la EA, para la cual actualmente no existe ninguna prueba que pueda diagnosticar dicha enfermedad con precisión recurriéndose a la evaluación sistemática que elimina otras posibles causas.

La presente invención proporciona un nuevo biomarcador de alta especificidad y sensibilidad, con potencial diagnóstico para la EA donde, a partir de una muestra biológica de un sujeto, se detectan y/o cuantifican glicoformas de glicoproteínas mediante anticuerpos frente al glicoepítopo HNK-1.

Así, en la presente invención se muestra, que a partir de una muestra cerebral de un sujeto se detectan patrones que permiten diagnosticar dicha enfermedad con una sensibilidad mayor de un 80%, preferentemente entre el 83 y el 100%, y una especificidad mayor de un 65%, preferentemente entre el 67 y el 83%, valores acordes a los señalados como necesarios según el Consensus Report of the Working Group on "Molecular and Biochemical Markers of Alzheimer´s Disease" (1998; estudio esponsorizado por The Reagan Research Institute of the Alzheimer´s Association and The National Institute on Aging) . De igual forma, la presente invención provee de un método de diagnóstico altamente eficaz para descartar dicha enfermedad.

Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método, en adelante primer método de la invención, para determinar la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo, que comprende:

a. detectar y/o cuantificar las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 en dicha muestra biológica aislada, y

b. comparar los datos obtenidos en el apartado (a) con valores de referencia, para encontrar una desviación significativa.

El término “glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1”, tal y como se utiliza en la descripción se refiere a una proteína unida a una o varias moléculas de glicoepítopo HNK-1.

Son muchas las glicoproteínas cerebrales portadoras de dicho glicoepítopo. Así, pero sin limitarse, se ha descrito HNK-1 en las moléculas de adhesión celular NCAM (neural cell adhesion molecule) , telencefalina y tenascina-R [Yoshihara Y et al., Neurosci Res. 1991, 10, 83-105], en CD-24 (Lieberoth A et al., J Neurosci. 2009, 29, 6677-6690) , en la molécula periférica P0 (Bollensen E et al., Neurosci Lett 1987, 82, 77-82) , en la molécula de reconocimiento neural L1 (Hall H et al., J Neurochem. 1997, 68, 544-553) , las moléculas TAG-1 (Dodd et al., Neuron 1988, 1, 105-116) y F3/F11 (Rathjen FG et al., J Cell Biol. 1987, 104, 343-353) , y en otros muchos glicanos como neuroglicano C (Shuo T et al., Glycoconj J. 2004, 20, 267-278) , agrecano (Domowicz MS et al., Dev Dyn 2003, 226, 42-50) , distroglicano (Smalheiser NR et al., J Biol Chem. 1995, 270, 15425-15433) , MAG (Bartoszewicz ZP et al., J Neurosci Res. 1995, 41, 27-38) , somataglicano-S (Williams C et al., Neurochem.... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo, que comprende:

a. detectar y/o cuantificar las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 en dicha muestra biológica aislada, y

b. comparar los datos obtenidos en el apartado (a) con valores de referencia, para encontrar una desviación significativa.

2. Método según la reivindicación 1, que además comprende atribuir la desviación significativa a la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en el individuo.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 200 KDa.

4. Método según la reivindicación 3, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 100 KDa.

5. Método según la reivindicación 4, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 60 KDa.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las glicoproteínas del paso (a) son detectadas y/o cuantificadas por electroforesis.

7. Método según la reivindicación 6, donde la electroforesis se lleva a cabo mediante electroforesis de dos dimensiones.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las glicoproteínas del paso (a) son detectadas y/o cuantificadas por inmunoensayo.

9. Método según la reivindicación 8, donde el inmunoensayo se lleva a cabo mediante ensayo ELISA.

10. Método según la reivindicación 9, donde el ensayo ELISA se lleva a cabo mediante la fijación al soporte sólido de anticuerpos anti-HNK-1, anticuerpos contra la porción aminoacídica de la glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1, o de lectinas.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde se comparan los datos obtenidos en la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 con los valores de referencia que consisten en datos de detección y/o cuantificación de la proteína total.

12. Método según la reivindicación 11, donde se lleva a cabo el marcaje simultáneo y distinguible de proteína total y de dicha glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde dicha comparación se lleva a cabo mediante el cociente entre la concentración de proteína total y la concentración de la glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la muestra biológica del paso (a) es una muestra cerebral.

14. Método según la reivindicación 14, donde la muestra cerebral es un fluido biológico.

15. Método según la reivindicación 15, donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la muestra biológica del paso (a) es plasma.

17. Método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo, que comprende:

a. obtener datos de una primera comparación de la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 con valores de referencia, en una muestra biológica aislada de un individuo,

b. obtener datos de una segunda comparación según se describe en el apartado (a) en una muestra biológica aislada del individuo después de determinar la primera comparación, y

c. comparar los datos obtenidos según el apartado (b) con los datos obtenidos según el apartado (a) para buscar alguna desviación significativa.

18. Método según la reivindicación 18, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 200 KDa.

19. Método según la reivindicación 19, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 100 KDa.

20. Método según la reivindicación 20, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 60 KDa.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde las glicoproteínas son detectadas y/o cuantificadas por electroforesis.

22. Método según la reivindicación 22 donde la electroforesis se lleva a cabo mediante electroforesis de dos dimensiones.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde las glicoproteínas son detectadas y/o cuantificadas por inmunoensayo.

24. Método según la reivindicación 24, donde el inmunoensayo se lleva a cabo mediante ensayo ELISA.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, donde los datos de los valores de referencia con los que se compara la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 consisten en datos de detección y/o cuantificación de la proteína total.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, donde la muestra biológica aislada del individuo es una muestra cerebral.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, donde la muestra biológica aislada del individuo es plasma.

28. Uso del glicoepítopo HNK-1 como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo.

29. Uso de un kit que comprende al menos una molécula indicadora de la presencia o ausencia del glicoepítopo HNK-1 que porta una glicoproteína, para determinar la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo o para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo.

30. Uso de un kit según la reivindicación 30, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 200 KDa.

31. Uso de un kit según la reivindicación 31, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 100 KDa.

32. Uso de un kit según la reivindicación 32, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 60 KDa.

33. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, donde la molécula indicadora es, al menos, un anticuerpo específico de dicho glicoepítopo.

34. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, donde la muestra biológica aislada del individuo es una muestra cerebral.

35. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, donde la muestra biológica aislada del individuo es plasma.

FIG. 1

FIG. 2

A.

B. FIG. 3

A.

B. FIG. 4

FIG. 5