Método para correlacionar la histología y la actividad quinasa de una muestra biológica,

comprendiendo el método las etapas de: (i) proporcionar una muestra biológica crioconservada, en donde dicha muestra comprende una serie de secciones cortadas consecutivas; (ii) obtener los datos histológicos de un primer subconjunto de secciones de dicha serie de secciones; (iii) lisar un segundo subconjunto de secciones de dicha serie de secciones para obtener un lisado donde se conservan actividades enzimáticas específicas; (iv) ensayar el lisado de la etapa (iii) para determinar la actividad quinasa con uno o más sustratos enzimáticos que comprenden secuencias de aminoácidos inmovilizadas en una micromatriz; y (v) correlacionar la histología y la actividad quinasa de la muestra biológica

Campo de la Invención

La presente invención se refiere al ensayo de la actividad enzimática en una muestra biológica. En particular, la presente invención se refiere al ensayo de la actividad enzimática en lisados celulares obtenidos de muestras biológicas fijadas.

Antecedentes

Se están analizando muestras biológicas de diversas formas con diversos fines. La histología es un componente clave del diagnóstico de enfermedades humanas y animales. Típicamente, las muestras biológicas se fijan, se embeben, se seccionan y se tiñen con el fin de un examen histológico, citológico, hematológico o microbiológico. Es evidente que el objetivo de un fijador es la detención de la autolisis y de la descomposición bacteriana, la estabilización de los constituyentes celulares y tisulares, y la conservación de proteínas y sustancias tisulares. Están disponibles una gran diversidad de fijadores. Los fijadores universales empleados más ampliamente son aldehídos tales como formaldehído y glutaraldehído. Por ejemplo, el formaldehído, como formaldehído tamponado al 4% o formalina tamponada al 10%, se usa principalmente para secciones embebidas en parafina rutinarias. Los aldehídos forman entrecruzamientos entre proteínas, siendo la reacción principalmente con el aminoácido básico lisina, y también pueden estar implicados otros grupos tales como imino, amido, peptídicos, guanidilo, hidroxilo, carboxilo, SH y anillos aromáticos. Las proteínas solubles se fijan a proteínas estructurales y se vuelven insolubles.

Los fijadores alternativos incluyen agentes oxidantes tales como iones metálicos y complejos tales como tetróxido de osmio y ácido crómico; y agentes desnaturalizantes de proteínas tales como ácido acético, alcohol metílico (metanol) y alcohol etílico (etanol).

Típicamente, el uso de fijadores (químicos) como se ha descrito anteriormente puede posponerse hasta que sea necesario por archivado de las muestras biológicas después de embeberlas en una matriz de embebimiento tal como, por ejemplo, moldes de embebimiento de plástico. El examen de la anatomía microscópica proporciona nuevas percepciones importantes de los mecanismos patológicos, aunque la fijación de una muestra biológica es incompatible con el análisis bioquímico de la función de proteínas o de la actividad enzimática en esa muestra debido a que la fijación, por su propia naturaleza, destruye las células y congela los procesos celulares dinámicos, y la presencia de pequeñas moléculas difundibles y la actividad enzimática se pierden durante la fijación química.

Sin embargo, un estudio adicional de la función de proteínas y el análisis de las reacciones enzimáticas en una muestra biológica que se selecciona por examen histológico reforzaría el valor de la investigación clínica y del diagnóstico in vitro.

La transducción de señales es una de las áreas más importantes de investigación en la investigación biológica e implica muchos tipos de interacciones. Uno de los mecanismos principales empleado frecuentemente por las células para regular su actividad y, en particular, para regular los procesos de transducción de señales, implica cambios en la fosforilación de proteínas. Se cree que tantas como 1000 proteínas quinasas y 500 proteínas fosfatasas en el genoma humano están implicadas en los procesos de fosforilación. Las dianas de fosforilación incluyen un gran grupo de moléculas de señalización, incluyendo enzimas.

La actividad de moléculas biológicamente activas, tales como enzimas, también está regulada con frecuencia por interacciones directas con otras moléculas o moléculas reguladoras. La regulación de enzimas controla su actividad proporcionando un intervalo completo de control, de muy fino a aproximado. Se usan muchos mecanismos para regular, por ejemplo, inhibir enzimas en sistemas vivos.

En general, a pesar de los muchos progresos, el sistema complejo en el que sustratos particulares se someten a la acción o acciones de enzimas específicas requiere todavía muchos exámenes moleculares para caracterizar propiedades todavía desconocidas de enzimas que dirigen rutas de señalización que, a su vez, controlan el crecimiento celular, la progresión de enfermedades y la diferenciación celular.

La presente invención proporciona el ensayo de la actividad de características subcelulares, en particular enzimas, con respecto al diagnóstico histológico de una muestra biológica, llenando el vacío entre los datos de ensayo tradicionales y de la biología molecular.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar métodos para ensayar la actividad enzimática de muestras biológicas examinadas por histología.

La presente invención tiene como objetivo correlacionar la histología y la actividad enzimática de una muestra biológica.

En particular, la presente invención tiene como objetivo proporcionar datos de la actividad enzimática para una muestra biológica seleccionada por su patrón histoquímico o inmunohistoquímico.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar métodos para explorar la actividad enzimática en una plataforma múltiple.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar ensayos enzimáticos que puedan automatizarse, en particular en la industria farmacéutica, ya que las moléculas biológicamente activas tales como enzimas desempeñan con frecuencia papeles clave importantes en el descubrimiento de fármacos.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar métodos para la diferenciación de muestras clínicas basándose en la actividad enzimática en la investigación clínica y el diagnóstico in vitro.

Descripción Resumida de la Invención

La presente invención proporciona un nuevo método para la medición de la generación de perfiles y huellas de la actividad quinasa en lisados de muestras preparadas conjuntamente y examinadas histológicamente. En particular, la presente invención proporciona un método para correlacionar la histología y la actividad enzimática de una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una muestra biológica crioconservada, en la que dicha muestra comprende una serie de secciones cortadas consecutivamente;

(ii) obtener datos histológicos de un subconjunto de secciones de dicha serie secciones;

(iii) lisar un segundo subconjunto de secciones de dicha serie de secciones para obtener un lisado en el que se conserven actividades enzimáticas específicas;

(iv) ensayar el lisado de la etapa (iii) para determinar su actividad quinasa con uno o más sustratos enzimáticos que comprenden secuencias de aminoácidos inmovilizadas en una micromatriz; y

(v) correlacionar la histología y la actividad quinasa de la muestra biológica.

Los métodos de acuerdo con la presente invención contribuyen al descubrimiento de rutas relacionadas con enfermedad a nivel de la señalización celular. Los presentes métodos son valiosos para el descubrimiento y validación de nuevas dianas. Una diana es una molécula o estructura molecular cuya actividad, cuando se ve influenciada por cualquier medio, tendrá efectos deseables sobre las células que contienen esta molécula. Un diana es una proteína o una enzima que puede usarse (como diana) por la industria farmacéutica para desarrollar nuevos fármacos. Al mismo tiempo, este tipo de huella de la actividad enzimática puede usarse como herramienta para encontrar conjuntos de biomarcadores de toxicidad y eficacia predictivos que puedan usarse como ayuda en ensayos clínicos en el campo de la oncología. La expresión “eficacia predictiva” se refiere a la medición de un efecto por, por ejemplo, un fármaco en una diana. La expresión “conjunto de biomarcadores de toxicidad” se refiere a la medición de efectos secundarios de un fármaco sobre una no diana. Por lo tanto, los datos de histopatología y biología molecular pueden mostrar efectos indirectos de un tratamiento farmacológico. Los efectos de fármacos sobre otras partes de una célula que no sean la diana conducen con frecuencia a efectos secundarios no deseados. Los métodos de la presente invención permiten la predicción de estos denominados efectos fuera de diana de modo que puedan prevenirse los efectos secundarios.

Descripción Detallada de la Invención

Antes de describir el presente método y dispositivos usados en la invención, debe entenderse que esta invención... [Seguir leyendo]

1. Método para correlacionar la histología y la actividad quinasa de una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una muestra biológica crioconservada, en donde dicha muestra comprende una serie de secciones cortadas consecutivas;

(ii) obtener los datos histológicos de un primer subconjunto de secciones de dicha serie de secciones;

(iii) lisar un segundo subconjunto de secciones de dicha serie de secciones para obtener un lisado donde se conservan actividades enzimáticas específicas;

(iv) ensayar el lisado de la etapa (iii) para determinar la actividad quinasa con uno o más sustratos enzimáticos que comprenden secuencias de aminoácidos inmovilizadas en una micromatriz; y

(v) correlacionar la histología y la actividad quinasa de la muestra biológica.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica de la etapa (i) se trató con un crioconservante.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho crioconservante es un compuestoOCT (Temperatura de Corte Óptima).

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sustrato comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que incluye péptidos, proteínas, enzimas, receptores de hormonas, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo y haptenos.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha micromatriz es un soporte sólido de flujo continuo tridimensional que comprende canales que lo atraviesan.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos sustratos se inmovilizan en la superficie interna de los canales dentro del soporte sólido que lo atraviesan.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho soporte sólido es un soporte de un óxido de metal.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho soporte de óxido de metal es un soporte de óxido de aluminio.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ensayo del lisado para la reacción enzimática con uno o más sustratos es por incubación dinámica, en el que dicha incubación dinámica comprende someter el soporte poroso a al menos un ciclo de flujo del lisado hacia delante y hacia atrás a través de los canales que lo atraviesan.

10. Uso de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la diferenciación de muestras clínicas basándose en la actividad enzimática en la investigación clínica y el diagnóstico in vitro.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, para el cribado de fármacos.