MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UN ANALITO NO VOLÁTIL.

Método para determinar la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso con el uso de un sensor óptico que contiene un colorante indicador luminiscente inmovilizado en al menos una de sus capas,

cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario, y que se caracteriza por que además comprende: Medir la luminiscencia del sensor en seco en el lugar del usuario, sin el uso de medios de calibración, lo que da lugar a un valor de calibración en seco en el emplazamiento del usuario, y Deducir la concentración de analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación de húmedo a seco obtenida in situ en fábrica y deducida de un valor de calibración en húmedo in situ en fábrica y un valor de calibración en seco in situ en fábrica y el valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario

La invención se refiere a un método para la determinación de la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso que utiliza un sensor óptico, que contiene un colorante indicador luminiscente inmovilizado en al menos una de sus capas, cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de

10 muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario Estado de la técnica Los analizadores para la determinación de las sustancias no volátiles en un líquido (por ejemplo, las sustancias iónicas como el H+ (pH), Na+, K+, Ca++, Cl-, las moléculas neutras o cargadas como la glucosa, urea o lactato) se utilizan en la tecnología de la fábrica, ambiental y médica. El diagnóstico clínico, en particular, se basa en un equipo analizador para la determinación de los así llamados “analitos de pacientes en estado crítico” en los fluidos biológicos como la orina, el plasma, el suero y sobre todo la sangre entera. Dichos sistemas comprenden frecuentemente diversos elementos sensores para determinar los parámetros

respectivos. Dichos elementos sensores se podrán utilizar para una determinación única (un solo uso) o se reutilizarán para múltiples determinaciones (uso múltiple).

Los elementos sensores de este tipo utilizan a menudo tecnologías de detección electro-químicas o bien óptico-químicas para la determinación de los parámetros de gas, valores de pH, valores iónicos o bien valores del metabolitos en los diagnósticos clínicos. Preferiblemente en un “cartucho” se unen una pluralidad de elementos sensores para la determinación de diversos analitos (ver, por ejemplo, Ann. Biol. Clin. 61, 183-91, 2003).

El diagnóstico clínico requiere un nivel elevado de exactitud en los resultados de las mediciones. Además, una etapa de medición única debería aportar valores de medición para un gran número de sustancias. Además se espera que los resultados de la medición se presenten con un retraso mínimo y que el coste por valor de medición sea bajo. A menudo es preferible que las mediciones se realicen cerca del paciente, por ejemplo, “junto a la cama”, en el despacho del médico o en la unidad de cuidados intensivos.

Como consecuencia de ello, no se aceptan los procedimientos de calibración que requieren tiempo, que implican varios medios de calibración antes de realizar la medición real, en particular cuando se hace referencia a sensores “de un solo uso”. Puesto que el coste de los aparatos en miniatura y de los elementos sensores debe ser mínimo, los procedimientos que requieren aparatos caros, elementos sensores complejos, o bien muchos fluidos y otros elementos no

son los adecuados.

Los sensores electroquímicos pueden estar basados en uno de los múltiples principios de medición, como los principios de medición potenciométricos, amperométricos o conductométricos. Todos los principios requieren el uso de un electrodo de referencia y a menudo se aplican en configuraciones que requieren el contacto con un fluido de calibración húmedo antes de realizar la medición de la muestra desconocida.

La patente americana 4.734.184 (Burleigh y cols.) muestra un montaje de electrodos para controlar la concentración de una serie de gases e iones presentes en la sangre. Aunque el montaje se almacena en seco para promocionar un periodo de vida amplio, los electrodos son hidratados intensamente antes de ser utilizados.

La patente 4.654.127 (Baker y cols.) muestra un aparato sensor equipado con unos sensores selectivos según las especies y un depósito con diversas cámaras que puede girar, en el cual se encuentran las soluciones de muestra y la solución de calibración en cámaras separadas. Este dispositivo permite detectar muchas especies químicas. Además, estos sensores disponibles en el comercio se guardan en un envase con elevada humedad (prácticamente húmedos). Este método de envasado tiene el efecto de limitar el periodo de caducidad de estos dispositivos sensores.

La patente americana 5.112.455 (Cozette y cols.) muestra un dispositivo sensor dotado de un electrodo de referencia y al menos un sensor básicamente almacenado en seco,

capaz de exhibir una respuesta a los cambios en la concentración de una especie de analito preseleccionada antes de que el sensor adquiera una humedad totalmente equilibrada. Sin embargo, el sensor y el electrodo de referencia deben ponerse en contacto con un líquido calibrador antes de que los electrodos alcancen un estado de “humedad” equilibrado, para conseguir información analítica significativa a partir de dichos electrodos en estado sólido.

En JAMES K. TUSA, HUARUI HE “Critical care analyzer with fluorescent optical chemosensors for blood analytes” JOURNARL OF MATERIALS CHEMISTRY, vol. 15, 13 May 2005(200505-13), páginas 2640-2647, se resume la aplicación de sensores fluorescentes a sistemas diagnósticos in vitro.

Los sensores o los optodos utilizados en el analizador descrito por este documento se incorporan a un cartucho desechable. Para la medición del pH los iones hidrógeno de la sangre se unen a un colorante indicador fluorescente sensible al pH que se encuentra inmovilizado en la capa sensible de un optodo. El colorante indicador HPTS existe en dos estados, protonado y deprotonado, en unas cantidades relativas determinadas por el pH de su entorno local (en equilibrio con la muestra sanguínea), por lo que la luminiscencia depende de la concentración del analito. Cada cartucho desechable de un solo uso mide hasta ocho analitos tras una calibración puntual de la intensidad en su nivel de analito fisiológico respectivo, en combinación con un código de barras de la fábrica específico del lote con unos datos de calibración y expiración. Inmediatamente antes del

uso se comprueba la calibración de la fábrica con unos tampones de precisión y mezclas de gas.

Los sensores óptico-químicos se pueden basar en uno de los diversos principios de medición ópticos, como los principios de medición de la fluorescencia, absorbancia o reflectancia. Se aplican en una serie de configuraciones de medición diversas y, en contraste con los sensores electro-químicos, los sensores ópticos normalmente no requieren un electrodo o sensor de referencia.

Un sensor óptico-químico o bien óptico-bioquímico consiste normalmente en una o más capas de sustancias inorgánicas y/o bien orgánicas, preferiblemente poliméricas, que se aplican a un portador o sustrato transparente, con al menos una capa que contiene un colorante cuyas características ópticas (absorción, luminiscencia) varían con la concentración de un analito en particular contenido en un medio de muestreo. Los sensores óptico-bioquímicos contienen al menos un agente bioquímico o bien biótico de origen natural, por ejemplo un enzima. El portador puede ser plano, cilíndrico o de cualquier otra forma. Por ejemplo, las capas se pueden aplicar a los “pocillos” de las microplacas, en la punta de haces de fibra óptica o en las fibras ópticas individuales o en estructuras conductoras de la luz.

Un sensor óptico-químico es capaz de medir de forma reversible y a menudo continuada. Las excepciones a esta norma son ciertos sensores bioquímicos portadores de enzimas. Estos miden de forma no continua y a menudo consumen

un sustrato o reactivo (como el oxígeno), es decir, ellos o su sustrato o reactivo son consumidos o alterados y deben ser regenerados para posteriores mediciones. Puesto que generalmente los sensores tienen un tiempo de vida limitado, deben ser reemplazados en ciertos intervalos.

Se coloca un sensor óptico-químico en contacto directo con el medio de muestreo y, cuando se expone a la luz, aporta información legible ópticamente acerca de un analito de interés especial, que está presente en el medio de muestreo (por ejemplo, la concentración, actividad o la presión parcial).

La mayoría de los sensores óptico-químicos requieren varias mediciones de calibración con medios de calibración, de manera que las concentraciones de analito se encuentran distribuidas por todo el campo de medición. El número de mediciones de calibración requeridas depende de la exactitud de medición deseada en el margen de medición pertinente, de manera que la exactitud y el intervalo...

1. Método para determinar la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso con el uso de un sensor óptico que contiene un colorante indicador luminiscente inmovilizado en al menos una de sus capas, cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario, y que se caracteriza por que además comprende:

Medir la luminiscencia del sensor en seco en el lugar del usuario, sin el uso de medios de calibración, lo que da lugar a un valor de calibración en seco en el emplazamiento del usuario, y

Deducir la concentración de analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación de húmedo a seco obtenida in situ en fábrica y deducida de un valor de calibración en húmedo in situ en fábrica y un valor de calibración en seco in situ en fábrica y el valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que comprende c) in situ en fábrica

sores secos elegidos So, obteniendo los valo

res de calibración en seco in situ en fábrica;

iii. posteriormente medir la luminiscencia de cada uno de los sensores So en contacto con al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones diferentes del analito no volátil, dando lugar a valores de calibración en húmedo en fábrica;

iv. obtener una relación húmedo a seco de los sensores So a partir de los valores de calibración húmedos en la fábrica y los valores de calibración en seco en la fábrica, de forma que la relación húmedo a seco se toma como la relación húmedo a seco para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo.

b) en el lugar donde se encuentra el usuario

i. medir la luminiscencia de un sensor seco S1 a partir de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo, dando lugar a un valor de calibración en seco en el lugar del usuario;

ii. obtener un valor de medición del sensor S1 en contacto con el medio de muestreo acuoso; y

iii. calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso a partir del valor de medición de la luminiscencia, el valor de calibración en seco en el lugar del usuario y la relación húmedo a

seco obtenida in situ en fábrica.

3. Método conforme a la reivindicación 2, por el cual la relación húmedo a seco comprende una característica relativa y un valor proporcional y además

en la etapa a) iv. Obtener a partir de los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica la característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y deducir el valor proporcional de los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica y de los valores de calibración en seco in situ en fábrica, cuyo valor proporcional se toma como el valor proporcional para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor de luminiscencia, el valor de calibración en el lugar ocupado por el usuario, la característica relativa y el valor proporcional obtenido in situ en fábrica.

4. Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fá

brica LmD*

en la etapa a) iii. elegir la concentración del analito S para al menos uno de los medios de calibración acuosos de manera que después de la humectación y el equilibrio solamente esté presente la especie B y medir los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, en la etapa a)iv. calcular un valor proporcional RmD/W a partir de los valores de calibración en seco y en húmedo in situ en fábrica LmD* y LmW* en la etapa b)i. obtener un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LmD, y en la etapa b)iii. calcular un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LmD y el valor proporcional RmD/W y determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

5. Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, y el cociente V de la concentración (cB) de la especie B relativo a la concentración total (cD) del colorante luminiscente (V=cB/cD), donde cD es la suma de la concentración (cA) del colorante luminiscente presente en forma de especie A y la concentración

(cB) del colorante luminiscente presente en forma de especie B, siendo conocidos y estando entre 0,1 y 0,9, preferiblemente entre 0,3 y 0,7. en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* en la etapa a) iii. elegir la concentración del analito S para al menos uno de los medios de calibración acuosos de manera que después de la humectación y el equilibrio solamente esté presente la especie B y medir los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, en la etapa a)iv. calcular un valor proporcional RmD/W a partir de los valores de calibración en seco y en húmedo in situ en fábrica LD* y LmW* en la etapa b)i. obtener un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LD, y en la etapa b)iii. calcular un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LD y el valor proporcional RmD/W y determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

6. Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una es

pecie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, y el cociente V de la concentración (cB) de la especie B relativo a la concentración total (cD) del colorante luminiscente (V=cB/cD), donde cD es la suma de la concentración (cA) del colorante luminiscente presente en forma de especie A y la concentración (cB) del colorante luminiscente presente en forma de especie B, siendo conocidos y estando entre 0,1 y 0,9, preferiblemente entre 0,3 y 0,7. en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* en la etapa a) iii. medir la intensidad de luminiscencia de los sensores So para al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones conocidas cSi del analito S dando lugar a al menos dos valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LiW*, y en la etapa a)iv. obtener las características relativas y los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW * de los sensores So a partir de los pares de valores LiW*, cSi conforme a LmW*= LiW *(1+(q-1)/(1+cSi/Kd)), donde los valores q y Kd son conocidos, y se obtienen por ejemplo de la calibración in situ en fábrica, y calcular a partir de ello la característica relativa válida para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo, y calcular un valor proporcional RD/W a partir de los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* y los valores

de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, que dan en la etapa b)i. un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LD, y en la etapa b)iii. un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LD y el valor proporcional RmD/W y permiten determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

7. Método conforme a la reivindicación 2, que comprende en la etapa a) iv. Obtener a partir de los valores de calibración en húmedo y en seco in situ en fábrica una característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor de luminiscencia, el valor de calibración en el lugar ocupado por el usuario y la característica relativa obtenida in situ en fábrica.

8. Método conforme a la reivindicación 2, que comprende en la etapa a) iv. Calcular los valores proporcionales de los valores de calibración en húmedo y en seco in situ en fábrica; y obtener una característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular un valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario a partir del valor de calibra

ción en seco en el lugar ocupado por el usuario y del valor de luminiscencia; y calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario y la característica relativa.

9. Método conforme a la reivindicación 7 o bien 8, que se caracteriza por que al menos m sensores son seleccionados in situ en fábrica y se obtienen m valores de calibración en seco ti con i=1 a m, y por que se toman al menos uno de n>2 medios de calibración acuosos distintos, utilizándose cada medio de calibración al menos una vez, de manera que se obtienen k>n valores de calibración en húmedo kij con j=1 a n, y que los valores proporcionales kij/ti se calculan a partir de los valores individuales ti, kij y se deduce la característica relativa del sensor a partir de esos valores proporcionales.

10. Método conforme a la reivindicación 5 o bien 6, que se caracteriza por que para el ajuste de un cociente conocido, predeterminado V =cB/cD de las especies A y B, con cD=cA+cB, en los sensores Sn, el sustrato que lleva el indicador o el sensor se lava con un medio de lavado acuoso, que contiene el analito o un análogo de analito en una concentración adecuada, habiendo establecido el cociente predeterminado después del equilibrio y habiéndolo fijado mediante el secado del sustrato portador del indicador o el sensor.

11. Método conforme a la reivindicación 10, que se caracte

riza por que para sensores de pH se utilizan ácidos, bases

o tampones con pH conocidos como medio de lavado.

12. Método conforme a la reivindicación 10 ó 11, que se caracteriza por que para cada sensor en seco de una plurali

5 dad de sensores Sn fabricados del mismo modo, el cociente de las especies A y B es esencialmente el mismo y constante todo el tiempo.

13. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se caracteriza por que los sensores ópticos se

10 guardan en estado en seco in situ en fábrica y en el lugar del usuario.

14. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que se caracteriza por que al menos un sensor óptico se emplea para la determinación de un analito no volátil en

15 combinación o en una configuración conjunta de sensores para determinar la concentración de analitos volátiles, como el O2 o el CO2.