MÉTODO PARA DETECTAR PROBNP CON UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE FIJA LOS AMINOÁCIDOS 42-46.

Método para detectar proBNP con un anticuerpo monoclonal que fija los aminoácidos 42-46 La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a una subpoblación de proBNP total llamada proBNP nativo, a un método para la detección específica de proBNP nativo, a un método para relacionar el nivel de proBNP nativo con el diagnóstico de fallo cardíaco, a un kit para la detección de proBNP nativo y a una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo del proBNP nativo. El fallo cardíaco es un fenómeno generalizado, sobre todo en el mundo occidental. Según el diccionario médico Roche (Urban & Schwarzenberg, 1993) el fallo cardíaco es la incapacidad aguda o crónica del corazón para generar el flujo sanguíneo requerido por el metabolismo durante el ejercicio, o incluso en reposo, o para asegurar el reflujo venoso (insuficiencia cardíaca retrógrada y anterógrada). Por tanto la función de bombeo del corazón es débil. Las causas de fallo cardíaco son muy complejas. Entre otras cabe mencionar alteraciones inflamatorias y degenerativas del músculo cardíaco, trastorno de la perfusión coronaria, infarto y lesiones coronarias, que provocan modificaciones del riego sanguíneo periférico, trastornos del sistema respiratorio, de la función renal y del metabolismo electrolítico (edema) y menor rendimiento del sistema muscular del esqueleto. Conforme a la Asociación cardíaca de Nueva York (New York Heart Association (NYHA)) la insuficiencia cardíaca se divide en las siguientes clases NYHA, mediante pruebas físicas posteriores al esfuerzo: I significa ausencia total de dolor después del esfuerzo físico normal, II significa pequeña limitación de la resistencia física, III significa fuerte limitación de la resistencia física, IV significa que los síntomas de insuficiencia aumentan con cada actividad física y también existen en reposo la mayor parte del tiempo. Para tratar eficazmente la insuficiencia cardíaca con medicamentos del tipo de los glicósidos, vasodilatadores, inhibidores ACE y/o bloqueadores-ß, primero hay que identificarla y diagnosticarla de manera exacta y correcta, clasificándola, si es posible, según el nivel de gravedad, y además controlar el curso del tratamiento. En el estado técnico se habla de algunos marcadores séricos como posibles indicadores de un diagnóstico precoz de insuficiencia cardíaca, como por ejemplo ANP (hormona peptídica natriurética atrial) y proANP, CNP (péptido natriurético C), adrenomedulina, neuropéptido Y, endotelina y BNP (péptido natriurético cerebral). Teóricamente el ANP y el proANP serían marcadores adecuados para el diagnóstico de la insuficiencia cardíaca; sin embargo en la práctica no son muy estables o su vida media en la sangre es corta, lo cual supone una gran desventaja para las mediciones diagnósticas rutinarias (Buckley, M.G., y otros, Clin. Sci. 95 (1998) 235-239; Cleland, J.G., y otros, Heart 75 (1996) 410-413). Un marcador frecuentemente citado y valioso es el BNP (péptido natriurético cerebral). Al principio el BNP se detectó en el cerebro de los cerdos. Es una hormona cardíaca parecida estructural y funcionalmente al ANP (péptido natriurético atrial) (Sudoh, T., y otros, Nature 332 (1988) 78-81). El BNP humano consta de 32 aminoácidos, es secretado principalmente por los ventrículos del corazón y circula por el plasma sanguíneo humano. El uso del BNP como marcador diagnóstico es conocido por ejemplo a través de la patente EP-A-0 542 255. El BNP tiene un puente disulfuro intramolecular y no es un analito muy estable. Ello es debido probablemente a su función fisiológica como hormona que debe descomponerse con rapidez. Por tanto su empleo como marcador diagnóstico requiere cuidado y especial atención al recoger y procesar las muestras (Masuta, C., y otros, Clin. Chem. 44 (1998) 130; Tsuji, T., y otros, Clin. Chem. 40 (1994) 672-673). La molécula precursora del BNP, es decir el proBNP, consta de 108 aminoácidos y se divide en los 32 aminoácidos C-terminales antes citados (77-108), llamados BNP, y en los aminoácidos 1-76 N-terminales, llamados proBNP (o NT-proBNP). El BNP, el proBNP N-terminal (1-76) y otros productos de descomposición (Hunt, P.J., y otros, Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995) 1175-1183) circulan en la sangre. No está totalmente aclarado si la molécula precursora completa (proBNP 1-108) también se encuentra en el plasma. No obstante se ha descrito (Hunt, P.J., y otros, Peptides, vol. 18, nº 10 (1997), 1475-1481) que en el plasma se puede detectar una pequeña liberación de proBNP (1-108), aunque faltan algunos aminoácidos, debido a la descomposición parcial muy rápida en el extremo N-terminal. Como es sabido del estado técnico, el proBNP N-terminal (1-76) se considera un marcador de insuficiencia cardíaca. La patente WO 93/24531 (US 5,786,163) describe un método inmunológico para identificar el proBNP N-terminal y los anticuerpos empleados para ello. En la patente WO 93/24531 se producen anticuerpos policlonales contra un único péptido derivado del proBNP N-terminal. Se demuestra que los anticuerpos producidos se unen al péptido de inmunización (aminoácidos 47-64) en el formato de ensayo competitivo. En el ensayo competitivo realizado en la patente WO 93/24531 el péptido 47-64 marcado compite como trazador con proBNP en una muestra o con el péptido 47-64 estándar sin marcar, para unirse a anticuerpos policlonales de suero de conejo. Después de 48 horas solo se alcanza una competición moderada, dando como resultado un límite inferior de detección de 250 fmol/ml, aproximadamente. Los largos tiempos de incubación de este ensayo competitivo no 2   son aceptables para mediciones rutinarias de muestras en laboratorios automatizados. Hunt, P.J., y otros, Clinical Endocrinology 47 (1997) 287-296, también describen un ensayo competitivo para detectar proBNP N-terminal. Este ensayo requiere una compleja extracción de la muestra de plasma antes de poder hacer las mediciones, lo cual puede provocar la destrucción del analito y mediciones erróneas. El antisuero empleado se produce análogamente a la patente WO 93/24531 por inmunización con un péptido sintético. Hunt y otros producen el antisuero por inmunización con los aminoácidos 1-13 del proBNP N-terminal, usando como patrón un péptido con los aminoácidos 1-21. Para este ensayo también se necesitan tiempos de incubación largos. Tras 24 de incubación se alcanza un límite inferior de detección de 1,3 fmol/ml. Ng, L., y otros, WO 00/35951, describen otro método para diagnosticar proBNP N-terminal. Este método se basa en el uso de anticuerpos concebidos contra un péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 65 hasta 76 del proBNP humano. Hughes, D., y otros, Clin. Sci. 96 (1999) 373-380, informan de dos diferentes ensayos para el proBNP N-terminal. En un primer ensayo se usa un anticuerpo policlonal generado por un inmunógeno que comprende un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 65-76 del proBNP, mientras que en un segundo ensayo el anticuerpo policlonal se genera de modo análogo, pero a los aminoácidos 37-49. Según los datos producidos por Hughes, D., y otros, un anticuerpo generado y reactivo con el péptido correspondiente a los aminoácidos 37-49 del proBNP no reacciona con proBNP endógeno intacto. Un ensayo basado en este último no discrimina entre pacientes con disfunción ventricular izquierda y controles normales. Con el ensayo basado en proBNP 65-76 se pudo discriminar claramente el mismo grupo de pacientes. Goetze, J.P. y otros, Clin. Chem. 48 (2002) 1035-1042, describen un ensayo para los aminoácidos más N-terminales (1-21) del proBNP N-terminal. Su ensayo se basa en un anticuerpo policlonal concebido contra un péptido sintético correspondiente a los mismos aminoácidos (1-21) del proBNP. El ensayo antedicho de Goetze, J.P. y otros requiere la digestión completa de la muestra y los distintos proBNPs que comprende. Se dice que este ensayo también fue eficiente para reducir la fijación inespecífica. Karl, J. y otros, WO 00/45176, demostraron por primera vez que la detección sensible y rápida de proBNP N-terminal también es posible en un inmunoensayo sándwich. Tal como está descrito en la patente WO 00/45176 los epítopos preferidos se hallan entre los aminoácidos 10 y 50 del proBNP N-terminal. La patente US 2003/0219734 se refiere al hecho de que en una muestra pueden estar presentes varios polipéptidos distintos, derivados del proBNP (1-108), del BNP (77-108), así como del proBNP N-terminal (1-76). Mair, J., y otros, Clin. Chem. Lab. Med. 39 (2001) 571-588, han resumido el impacto de la determinación de péptidos natriuréticos cardíacos en el diagnóstico y control del fallo cardíaco. Resaltan que los ensayos comerciales actualmente disponibles no están normalizados, es decir, que no han sido calibrados contra patrones... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se une específicamente a proBNP, el cual se fija específicamente a un epítopo formado por los aminoácidos 42-46 de proBNP y que, por los valores de proBNP determinados en muestras de pacientes mediante el uso de dicho anticuerpo, se correlaciona con un valor r de al menos r = 0,95 o superior con los valores de proBNP medidos en dichas muestras mediante el uso del anticuerpo monoclonal MAB 1.21.3 producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo DSM ACC2650 en la DSMZ, siendo dicho valor r determinado por análisis de regresión lineal. 2. El anticuerpo según la reivindicación 1, el cual es de tipo monoclonal. 3. El anticuerpo según la reivindicación 2, de modo que dicho anticuerpo monoclonal es MAB 1.21.3 producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo DSM ACC2650 en la DSMZ. 4. El anticuerpo según la reivindicación 1, el cual es un anticuerpo policlonal aislado. 5. Un método para la detección específica de proBNP in vitro que comprende las etapas de poner en contacto una muestra que contenga proBNP, supuesta o ciertamente, con un anticuerpo de proBNP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones tales que permitan la formación de un complejo anticuerpo de proBNP-proBNP y detectar el complejo formado. 6. El método según la reivindicación 5, por el cual dicha detección se lleva a cabo mediante un inmunoensayo competitivo. 7. El método según la reivindicación 5, por el cual dicha detección se lleva a cabo mediante un inmunoensayo sándwich usando además un segundo anticuerpo de proBNP, de modo que dicho segundo anticuerpo de proBNP y el anticuerpo de proBNP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 se unen a la misma subpoblación de proBNP formando así un segundo complejo anticuerpo de proBNP-proBNP-anticuerpo de proBNP. 8. Un método para diagnosticar insuficiencia cardíaca in vitro que comprende la detección específica de proBNP mediante el uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la determinación de la correlación del nivel de proBNP con la insuficiencia cardíaca. 9. Un kit para medir proBNP, que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y reactivos auxiliares para la detección de proBNP. 10. La línea celular de hibridoma MAB 1.21.3 depositada en la DSMZ con el número de acceso DSM ACC2650. 19   Análisis de epítopos con Mab1.21.3 péptido octámero   21 Fig. 2a Programa para la determinación de NT-proBNP en 20 muestras de pacientes con 8 anticuerpos distintos en Biacore, escrito y ejecutado con el programa BIACORE 3000 Control Software versión 4.1 DEFINIR APROG Sándwich CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE CLAVE TÍTULO Sándwich con Flujo Ruta de flujo Aguja inmersa *Inyección rápida RPunto inicio calibrador/suero humano Flujo *Inyección rápida Flujo Ruta de flujo Aguja inmersa *Inyección rápida RPunto Ruta de flujo Aguja inmersa *Inyección rápida RPunto Ruta de flujo Aguja inmersa *Inyección rápida RPunto Ruta de flujo Aguja inmersa *Inyección rápida RPunto   Ruta de flujo Flujo *Inyección rápida RPunto Flujo *Inyección rápida *Inyección rápida *Inyección rápida *Inyección rápida EXTRALIMPIO RPunto fin FIN DEFINIR APROG Regen. TÍTULO regeneración ciclo Flujo Ruta de flujo *Inyección rápida RPunto inicio *Inyección rápida *Inyección rápida *Inyección rápida RPunto fin FIN DEFINIR BUCLE AG TIEMPOS 1 !HBSlavado !HCl 100 mM !ácido fosfórico 100 mM !ácido fosfórico 100 mM !línea base tras regen. ciclo !HBSlavado !HCl 100 mM !ácido fosfórico 100 mM !ácido fosfórico 100 mM 22 Fig. 2b FIN   DEFINIR BUCLE AB TIEMPOS 1 FIN PRINCIPAL Soporte 2 Termo_a Soporte 2 Termo_c detección 1,2,3,4 BUCLE AB ORDEN desbloquear BUCLE AG ORDEN BUCLE FINAL BUCLE FINAL AGREGAR continua FIN 23 Fig. 2c   24     26