METODO PARA LA DETECCION DE UNA INTOLERANCIA LIGERA A LA GLUCOSA O HIPOSECRECION DE INSULINA.

Método para la eliminación de glucosa en una muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente ATPhexocinasa y ADP-hexocinasa para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra

Método para la detección de una intolerancia ligera a la glucosa o hiposecreción de insulina.

Antecedentes de la invención

Un objetivo final del tratamiento diabético consiste en prevenir la aparición de complicaciones diabéticas e inhibir el desarrollo de las mismas. Según ponen de manifiesto los ensayos clínicos para la consecución de este objetivo, es importante descubrir cualquier anomalía y comenzar el tratamiento de la misma en la fase más precoz posible [p.ej., Diabetes Research and Clinical Practice, 28, 103 (1995)].

Además, se considera efectivo como procedimiento preventivo más avanzado, encontrar personas con prediabetes o en las fases previas de la diabetes, o personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina que no se encuentran actualmente en el estadio prediabético pero que presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, y administrarles tratamiento o recomendarles ejercicio y dietas adecuadas. Se han llevado a cabo ensayos clínicos destinados a demostrar este hecho científicamente [p.ej., Diabetes Care, 21, 1720 (1998)]. Por consiguiente, la detección de las personas con prediabetes tendrá importancia en la prevención de la diabetes mellitus, así como de las complicaciones relacionadas con ésta. Asimismo, se considera que poder diagnosticar a personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina, que no se encuentran actualmente en el estadio prediabético pero que presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, resulta de vital importancia a fin de prevenir la diabetes mellitus de forma precoz.

Un ejemplo del procedimiento diagnóstico de la diabetes mellitus consiste en una prueba de tolerancia oral a la glucosa. Tras una sobrecarga oral de glucosa de 75 gramos, se define como tolerancia normal a la glucosa (NGT) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas inferior a 110 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre 2 horas después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL. Además, se define como glucemia anormal en ayunas (IFG) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no inferior a 110 mg/dL pero inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL; y se define como alteraciones de la tolerancia a la glucosa (IGT) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, no inferior a 140 mg/dL pero inferior a 200 mg/dL; y ambos grupos IFG e IGT se definen como de tipo límite. Se define como diabetes mellitus a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no inferior a 126 mg/dL o con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, no inferior a 200 mg/dL.

Las directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes (Japan Diabetes Society) determinan que entre las personas definidas como NGT sobre la base exclusivamente del nivel de glucosa en sangre en ayunas y del nivel de glucosa en sangre 2 horas después de la sobrecarga, aquellas que presenten niveles de glucosa en sangre, 1 hora después de la sobrecarga, de 180 mg/dL o superiores, corren un mayor riesgo de desarrollar diabetes, de forma que deberían tratarse como casos de tipo límite.

El término "alteraciones de la tolerancia a la glucosa" o "intolerancia a la glucosa" se refiere a la afección marcada por un aumento del nivel de glucosa en sangre causado por una absorción insuficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la glucosa en la sangre a través de las comidas. Además, el término "alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa" se refiere a que el incremento es ligeramente superior al que se produce en las personas sanas.

La insulina es una hormona secretada por las células beta del páncreas que actúa en los músculos esqueléticos, en el hígado y en el tejido adiposo a fin de disminuir el nivel de glucosa en sangre. El término "defecto secretor de insulina" se refiere a la afección marcada por una secreción de insulina insuficiente para absorber una cantidad suficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la glucosa en la sangre a través de las comidas o de cualquier otro modo. Dentro del defecto secretor de insulina, la afección marcada por una secreción de insulina insuficiente para absorber una cantidad suficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos justo después de la entrada de la glucosa en la sangre se denomina "secreción precoz alterada de insulina". Según las directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes, el término "secreción precoz alterada de insulina" se refiere a la afección en la que el índice insulinógeno I.I es inferior a 0,4. El índice insulinógeno I.I se define como ?IRI (30-0)/?PG (30-0), fórmula en la que ?IRI (30-0) se refiere a la diferencia entre los niveles de insulina en sangre 30 minutos después de la sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa; y ?PG (30-0) se refiere a la diferencia entre los niveles de glucosa en sangre 30 minutos después de la sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa.

Las pruebas analíticas para evaluar los niveles de glucosa y los niveles de insulina en sangre son procedimientos invasivos que precisan la extracción de sangre más de una vez en un corto período, infligiendo un dolor considerable a los pacientes. Por consiguiente, se necesita una prueba analítica sencilla, menos invasiva, que pueda resolver estas desventajas, preferentemente una prueba analítica no invasiva.

Por otra parte, se ha considerado que la determinación cuantitativa de mioinositol en una muestra biológica resulta útil en el diagnóstico de la diabetes mellitus, habiéndose documentado los siguientes informes.

(a) En la diabetes mellitus, se observó un incremento en el nivel de mioinositol en orina [Larner J. et al., New Eng. J. Med., 323, 373-378 (1990)].

(b) No se encontraron diferencias entre los tipos NGT y límite con respecto al nivel de mioinositol en orina [Susumu Suzuki, Diabetes Care, Vol. 17, No. 12 (1994) 1465-1468].

(c) El tipo límite (IFG; IGT) y la diabetes mellitus mostraron un nivel de mioinositol en orina superior al correspondiente al tipo NGT (JP 2001-190299 A).

Los informes (a) y (b) anteriores muestran los resultados obtenidos determinando los niveles de mioinositol en orina mediante CG/EM. Sin embargo, los datos plantean problemas de reproducibilidad y fiabilidad, debido a su variación entre los distintos examinadores. Por otra parte, en el informe (c), los resultados resultan más precisos y fiables que los obtenidos mediante CG/EM, puesto que se han obtenido determinando el nivel de mioinositol en orina con un reactivo para el análisis de mioinositol de alta sensibilidad que utiliza una enzima. De este modo, ha sido posible realizar la detección del grupo con prediabetes.

No obstante, el reactivo para el análisis de mioinositol utilizado en el informe (c) plantea problemas, tales como: (i) un insuficiente nivel inferior de detección, debido al estrecho intervalo de medición y a la necesidad de diluir una muestra para la determinación de diversos niveles de mioinositol en orina; y (ii) una insuficiente capacidad para evitar los efectos de las sustancias coexistentes en la orina, en particular de la glucosa. Por consiguiente, no ha sido posible conseguir la detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto secretor de insulina, que caen dentro de la NGT.

Se ha indicado por Kouzuma y otros, Clinica Chimica Acta 312 (2001) 143-151, un método de ciclización enzimática para la determinación cuantitativa de mioinositol en muestras biológicas.

El documento EP 1 008 657 A2 da a conocer un método y un reactivo para la determinación cuantitativa de 1,5-anhidroglucitol.

Además, si se evalúa que un paciente tiene NGT basándose exclusivamente en los niveles en sangre antes de una sobrecarga oral de glucosa de 75 g y transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa, tal juicio no refleja el cambio en el nivel en sangre de las 0 a las 2 horas. Por ejemplo, incluso las personas (con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y defecto secretor de insulina) que mantienen un nivel de glucosa en sangre...

1. Método para la eliminación de glucosa en una muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra.

2. Método para la determinación cuantitativa del nivel de mioinositol en una muestra utilizando enzimáticamente mioinositol dehidrogenasa en presencia de tio-NAD y NADH, caracterizado porque se utilizan en combinación dos tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.

3. Método para la determinación cuantitativa del nivel de mioinositol, según la reivindicación 2, en el que el agente eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.

4. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, caracterizado porque el compuesto comprende como mínimo:

1) tio-NAD;

2) NADH;

3) mioinositol dehidrogenasa;

4) dos tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.

5. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según la reivindicación 4, en el que el agente eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.

6. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el compuesto comprende además un tampón seleccionado entre:

Bicina(N,N-Bis(hidroxietil)glicina),

Tris(Tris(hidroximetil)aminometano); TEA(Trietanolamina), y

Tricina(N-Tris(hidroximetil)-metilglicina).

7. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la concentración final de tio-NAD es de 0,1mM o más.

8. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, caracterizado porque la concentración final de tio-NAD es de 2 a 10 mM.

9. Método para la eliminación de la glucosa de una muestra, que comprende como mínimo las siguientes fases:

hacer reaccionar ATP con glucosa de la muestra para convertirlas en ADP y glucosa-6-fosfato; y

hacer reaccionar el ADP obtenido de este modo con glucosa de la muestra para convertirlas en AMP y glucosa-6-fosfato.