Método para la detección de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.

Método para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis,

pertenecientes a los géneros Anaplasma/ Ehrlichia y al género Bartonella, que comprende las siguientes etapas:

a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que contenga cebadores que amplifiquen de forma específica las secuencias SEQ ID NO: 1-7 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia y las secuencias SEQ ID NO: 8-17 de especies de Bartonella, o sus respectivas secuencias complementarias,

b. Amplificar de manera simultánea las secuencias de la etapa (a) mediante reacción en cadena de la polimerasa,

c. Identificar las secuencias amplificadas de la etapa (b) usando las sondas que consisten en las SEQ ID NO: 26-42, o sus secuencias complementarias, para hibridar con las secuencias SEQ ID NO 1-17, y

d. Detectar la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis asociando las secuencias identificadas de la etapa (c) con una especie bacteriana que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia o al género Bartonella,

en el que las especies bacterianas que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. Ovina.

Método para la detección de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella

La presente invención, que se refiere a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella, es una patente de adición a la solicitud de patente española con número de publicación 2.264.642. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a cabo.

Estado de la técnica anterior

Actualmente, hay descritas unas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que el hombre puede padecer y que en países en vías de desarrollo constituyen una importante causa de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.

Del mismo modo, determinados tipos de zoonosis que están ampliamente extendidas en los países en vías de desarrollo, se están extendiendo en los países desarrollados como consecuencia de los aumentos de población en zonas urbanas y periurbanas, además del aumento de tráfico de animales a través de fronteras internacionales. Estas circunstancias, entre otras, conllevan un creciente riesgo de introducción de enfermedades exóticas en nuestro entorno.

Además, el hecho frecuente del hallazgo de artrópodos infectados por más de un patógeno incluido en la presente invención, aumenta las posibilidades de transmisión de más de una zoonosis a través de una única picadura. En este sentido, cada vez son más comunes las hospitalizaciones de individuos que presentan cuadros clínicos producidos por el contacto con animales o artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, etc., los cuales actúan como vectores o como reservorios de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente causante de la patología, no siendo posible la aplicación rápida de tratamientos específicos, que en ocasiones llegan demasiado tarde. Esta circunstancia justifica la necesidad de un método integrado de detección e identificación de especies bacterianas causantes de zoonosis.

Hasta el momento, los métodos de diagnóstico molecular disponibles se limitan básicamente a la detección de los patógenos mediante tecnología de anticuerpos. Este tipo de análisis, generalmente retrospectivo y en ocasiones de baja sensibilidad, suelen ser de escasa ayuda en para tratamiento de enfermedades en fase aguda.

Otra alternativa para la detección e identificación de patógenos se basa en la aplicación de medios de cultivo. Este tipo de técnicas es de escasa aplicabilidad para determinadas especies de géneros como Bartonella y Anaplasma/Ehrlichia, debido a que éstas no crecen generalmente en los medios de cultivo habituales e incluso pueden llegar a necesitar cultivos celulares. En consecuencia, estas metodologías están apartadas de las prácticas habituales en los laboratorios de microbiología de los hospitales. Una de las alternativas más eficaces a este tipo de metodologías la constituye el análisis directo de material genético, fundamentado en la tecnología de la PCR. Esta tecnología, aunque muy efectiva, encuentra su mayor limitación en la dificultad para encontrar marcadores o regiones específicas, así como cebadores y sondas, que permitan un análisis fiable de las muestras.

Recientemente, se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. et al. 2005. FEMS Microbiology Letters 243:273-8), que describe un método basado en el análisis de ADN ribosomal, aunque emplea cebadores universales, que amplifican material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son, lo que ocasiona que su sensibilidad sea bastante reducida.

Otros métodos como los descritos por las patentes americanas US 6.300.072 y 6.518.020 son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de la misma región (16S-23S), aunque sin embargo el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde el depósito de dichas patentes y su aproximación, que consiste en una discriminación entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies del género actualmente conocidas que comparten un tamaño de fragmento amplificado similar.

Schoulds L.M. et al. 1999 (Journal of clinical Microbiology, 37(7): 2215-2222) divulga un método para la detección simultánea de especies bacterianas que causan zoonosis pertenecientes a los géneros Ehrlichia y Bartonella mediante cebadores y sondas que amplifican regiones dentro del gen de ARNs 16S. Massung R.F. et al. 2003 (Journal of Clinical Microbiology, 41(2): 717-722) divulga una comparación de diferentes ensayos de PCR para determinar su sensibilidad analítica para detectar Anaplasma phagocytophilum. Los ensayos que proporcionan la mayor sensibilidad y especificidad para detectar células infectadas por Anaplasma phagocytophilum fueron el ensayo anidado de 16S y el ensayo de msp2.

Breve descripción de la invención

La presente invención propone el empleo de los genes 16S y msp2 y el espacio intergénico 16S-23S para la detección e identificación de diferentes especies y grupos de especies bacterianas zoonóticas, aportando mejoras respecto de los procedimientos descritos anteriormente, puesto que éste es capaz de detectar específicamente un número muy elevado especies bacterianas, mediante el empleo de sondas y cebadores con unos niveles de sensibilidad bastante elevados.

Así, la presente invención consigue resolver el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de especies bacterianas zoonóticas, que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección basado en la tecnología de la PCR. Concretamente, la invención permite analizar diferentes regiones del ADN bacteriano que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella para identificar ambos géneros y especies, según se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).

En la mayoría de los casos, las especies identificadas se corresponden a especies cultivadas y en otros se refieren a especies aisladas por primera vez (especies no cultivadas). Dichas especies han sido obtenidas a partir de muestras de las especies Metes metes (tejón), Ixodes ricinus y Apodemus sylvaticus y han sido caracterizadas por las secuencias AJ269792, SEQ ID NO:44-46, según se muestra en la tabla 3.

Breve descripción de las figuras

Figura 1.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Bartonella. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Bartonella. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.

Figura 2.- Esta figura muestra... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/ Ehrlichia y al género Bartonella, que comprende las siguientes etapas:

a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que contenga cebadores que amplifiquen de forma específica las secuencias SEQ ID NO: 1-7 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia y las secuencias SEQ ID NO: 8-17 de especies de Bartonella, o sus respectivas secuencias complementarias,

b. Amplificar de manera simultánea las secuencias de la etapa (a) mediante reacción en cadena de la polimerasa,

c. Identificar las secuencias amplificadas de la etapa (b) usando las sondas que consisten en las SEQ ID NO: 26-42, o sus secuencias complementarias, para hibridar con las secuencias SEQ ID NO 1-17, y

d. Detectar la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis asociando las secuencias identificadas de la etapa (c) con una especie bacteriana que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia o al género Bartonella,

en el que las especies bacterianas que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. Ovina.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los cebadores comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 18-25 o sus secuencias complementarias.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que además comprende los cebadores con secuencia SEQ ID NO: 51-52 para amplificar el control interno de amplificación del gen de THC sintasa de Cannabis sativa.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las sondas de la etapa (c) comprenden adicionalmente la sonda con secuencia SEQ ID NO: 50, capaz de hibridar con la secuencia SEQ ID NO: 49 del control de amplificación interno.

5. Sondas, cuya secuencia consiste en las SEQ ID NO: 26-32 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. ovina, y las secuencias SEQ ID NO: 33-42 de especies de Bartonella, o sus secuencias complementarias, siendo capaces dichas sondas de hibridar con las secuencias SEQ ID NO: 1-17 y/o con sus secuencias complementarias respectivas.

6. Un kit que comprende las sondas de acuerdo con la reivindicación 5.

7. El kit de acuerdo con la reivindicación 6, que además comprende los cebadores con secuencias SEQ ID NO: 1825.

8. Un uso del kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y al género Bartonella, en donde las especies bacterianas del género Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E. sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. ovina