Método para la detección e identificación rápidas de microorganismos.

Un método para determinar la presencia de microorganismos en un muestra e identificar y caracterizar dichosmicroorganismos si están presentes,

que comprende los pasos de:

(a) extraer ácidos nucleicos de los microorganismos, dichos ácidos nucleicos comprenden ácidosnucleicos diana;

(b) realizar una reacción de detección de la ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, quecomprende:

(b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácidonucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de dianalocalizada en 3' complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segundasonda de ácido nucleico comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5'complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmenteadyacente a y en 3' de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácidonucleico comprende una sección I de unión a cebador (PBS(I)) localizada en 5' y posiblemente unrelleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión a cebador(PBS(II)) localizada en 3' y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda deácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una regiónidentificadora que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de capturapreferiblemente en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleicodiana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador,

(b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segundasonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicoscomplementarios;

(b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente,

(b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) esesencialmente idéntico a la sección I de unión a cebador, y el segundo cebador (cebador II) esesencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundocebador está opcionalmente marcado, y

(b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido del paso (b3), en donde la amplificación se iniciamediante la unión del cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión a cebador,proporcionando así ácidos nucleicos diana amplificados, en donde una o más moléculas detectoras,

que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados están presentes en el paso (b5),

(c) seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha moléculadetectora, dicha modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dichasecuencia diana mediante lo cual se determina la presencia de un microorganismo,

(d) donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos dianaamplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y

(e) detectar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (d), mediante lo cual se identifica elmicroorganismo.

Método para la detección e identificación rápidas de microorganismos Campo de la invención La presente invención se refiere a un método rápido y eficaz para detectar la presencia de microorganismos e identificar los microorganismos en una muestra.

Antecedentes de la invención Tanto las aplicaciones clínicas como las aplicaciones en la industria alimenticia requieren métodos muy eficaces para el cribado de muestras sobre la presencia o ausencia de microorganismos patógenos. Mientras que los métodos de cribado para las aplicaciones clínicas requieren identificación de alto rendimiento, rápida y correcta de los microorganismos presentes en la muestra para fines diagnósticos, las aplicaciones en la industria alimenticia requieren métodos de alto rendimiento muy fiables para el control microbiológico y seguimiento microbiológico para validar la seguridad y la calidad de los productos alimenticios. Para ambos casos, se requieren métodos que permitan la detección, identificación y caracterización rápidas de microorganismos en varias muestras. Otros requisitos importantes para tales métodos de cribado son la facilidad de uso y la eliminación de errores (falsos positivos y/o falsos negativos) .

Varios métodos de cribado conocidos en la técnica tales como PCR en tiempo real permiten el cribado rápido y proporcionan un método para ensayar la presencia o ausencia de bacterias patógenas. Sin embargo, por ejemplo, después de detectar la presencia de microorganismos, la identificación adicional requiere ensayos multiparámetros, que generalmente no los pueden proporcionar estos métodos de cribado. Por ejemplo, la PCR en tiempo real permite solo el multiplexado limitado de biomarcadores. Además, la detección de pequeños cambios en las secuencias de ADN tales como los SNP con frecuencia es difícil.

Los métodos de prueba de identificación y caracterización típicos son lentos, laboriosos y requieren un alto nivel de experiencia para ejecutarlos y para interpretar los resultados. La determinación del subtipo de bacterias, o la determinación de la resistencia a antibióticos solo se puede hacer mediante métodos clásicos caros y laboriosos que requieren gran cantidad de experiencia. Además, los métodos moleculares de determinación de tipos (ribotipado, MLST, AFLP, MLVA, MicroSeq, rep PCR etc.) requieren que las pruebas se hagan en cepas puras. La purificación de las muestras con frecuencia también es un proceso muy tedioso, que lleva mucho tiempo. Por tanto, muchas de estas pruebas se realizan en laboratorios especializados. La principal desventaja de este planteamiento es que los resultados de la identificación adicional de las muestras positivas con frecuencia son muy tardíos para el uso práctico así como que son relativamente caros, tanto en el campo alimenticio como también en el clínico.

Se ha descrito un método para cribar eficazmente muestras sobre la presencia o ausencia de microorganismos patógenos y la posterior identificación de los microorganismos en el documento EP1633887. Sin embargo, un problema del método descrito en el documento EP1633887 es que todas las muestras se someten al proceso entero. Incluso si no se detectan microorganismos, se realiza el paso del cribado de las muestras en una micromatriz para todas las muestras. Puesto que generalmente más del 95% de las muestras de alimentos y muestras de control de agua son negativas para la presencia de microorganismos, muchas de estas muestras se prueban y se someten a identificación y caracterización de microorganismos que no están presentes en la muestra. Por tanto, el método de cribado descrito proporciona pasos de proceso evitables.

En vista de las consideraciones de tiempo y coste, la presente invención proporciona un método optimizado para la detección, identificación y caracterización de microorganismos en muestras. El método detecta en primer lugar si están presentes o no microorganismos en la muestra y en un paso posterior se lleva a cabo la identificación y caracterización solo en las muestras positivas.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a un método específico que logra la detección, identificación y caracterización rápidas y específicas de microorganismos contaminantes en varias muestras. Se ha desarrollado un método basado en la detección de secuencias de nucleótidos específicas de especie y/o específicas de cepa que únicamente se identifican y amplifican y posteriormente se detectan en una micromatriz usando oligonucleótidos ZIP identificadores direccionables (Zip-Comcode (cZIP) o Zipcode (ZIP) ) . Mediante el uso de un proceso de cribado de dos pasos, el método de la presente invención permite en primer lugar el cribado rápido de una multitud de muestras para la presencia o ausencia de microorganismos específicos en tales muestras, mientras que en un segundo paso de cribado los resultados positivos del primer paso se procesan adicionalmente para identificar y caracterizar los microorganismos detectados.

Figuras

Figura 1: Representación esquemática del ADN diana y las sondas de ligación amplificación en tiempo real específicas de la diana.

Figura 2: Representación esquemática del ADN diana y las sondas de ligación amplificación en tiempo real específicas de la diana, en donde la sonda I y la sonda II están acopladas. Solo las sondas ligadas proporcionan amplificación exponencial, que se detecta mediante una molécula detectora específica.

Figura 3: Gráficos de LDR en tiempo real de las muestras 1 a 6. El eje X muestra el número de ciclo; el eje Y las unidades de fluorescencia relativas corregidas para la fluorescencia de fondo. Las muestras 1 y 2 dan una (señal positiva) alta, lo que indica la presencia de Salmonella; las muestras 3 a 6 dan una señal muy baja lo que indica la ausencia de Salmonella en estas muestras.

Figura 4: Productos de reacción de LDR en tiempo real de las muestras 1, 2 y 3 hibridadas a una micromatriz usando el protocolo de detección de Salmonella PremiTest. El panel superior (amarillo) presenta la muestra 1, el panel medio (verde) presenta la muestra 2 y el panel inferior (azul) presenta la muestra 3. Las muestras 1 y 2 presentan un patrón de manchas típico para las serovariedades Virchow y Paratyphi B, respectivamente. La muestra 3 presenta solo las manchas de control de amplificación 16, 19 y 22: esto indica que la reacción se llevó a cabo adecuadamente y que esta muestra no contiene ADN de Salmonella.

Figura 5: Representación esquemática de pares de sondas preferidos. Las moléculas resultantes de la amplificación se representan después de la flecha. Se indica detección en tiempo real (RT) y/o por micromatriz. La sonda para la detección RT comprende una región complementaria (cDET) a la región DET. En este caso, para la detección por matriz, la micromatriz comprende sondas de captura que comprenden un Zipcode (ZIP) esencialmente complementario al ZipComcode (cZIP) .

Figura 6a, 6b y 6c: Representación esquemática de la detección en tiempo real de la reacción de amplificación usando respectivamente sondas Taqman, cebadores Scorpion y sondas de baliza molecular.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a métodos para recoger, detectar, identificar y caracterizar microorganismos contaminantes en artículos alimenticios, líquidos corporales y en el control del agua. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia y caracterización de microorganismos en una muestra usando dos pasos de detección, en el que el primer paso comprende la detección de la presencia de microorganismos a través de una molécula detectora, y un segundo paso comprende la identificación y caracterización adicionales de dicho microorganismo preferiblemente a través de un cebador marcado. Preferiblemente dicho primer paso comprende seguir la señal de moléculas detectoras, detectar ácidos nucleicos diana amplificados resultantes de una reacción de detección de ligasa en la esencialmente sondas adyacentes hibridadas a un ácido nucleico diana se unen, y posteriormente amplifican. Preferiblemente dicho segundo paso comprende detectar la hibridación de ácidos nucleicos diana amplificados a una sonda de captura.

En particular, la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de microorganismos en una muestra e identificar y caracterizar dichos microorganismos, que comprende los pasos de:

(a) posiblemente extraer los ácidos nucleicos de microorganismos , dichos ácidos nucleicos comprenden los ácidos nucleicos diana,

(b) realizar la reacción de detección de la ligasa (LDR) , preferiblemente reacción de detección de la ligasa en

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1. Un método para determinar la presencia de microorganismos en un muestra e identificar y caracterizar dichos microorganismos si están presentes, que comprende los pasos de: 5

(a) extraer ácidos nucleicos de los microorganismos, dichos ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos diana;

(b) realizar una reacción de detección de la ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, que comprende:

(b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de diana localizada en 3’ complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5’

complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmente adyacente a y en 3’ de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una sección I de unión a cebador (PBS (I) ) localizada en 5’ y posiblemente un relleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión a cebador (PBS (II) ) localizada en 3’ y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una región identificadora que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de captura preferiblemente en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador, (b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segunda sonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicos complementarios; (b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente, (b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) es esencialmente idéntico a la sección I de unión a cebador, y el segundo cebador (cebador II) es esencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundo cebador está opcionalmente marcado, y (b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido del paso (b3) , en donde la amplificación se inicia mediante la unión del cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión a cebador, proporcionando así ácidos nucleicos diana amplificados, en donde una o más moléculas detectoras,

que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados están presentes en el paso (b5) ,

(c) seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha molécula detectora, dicha modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dicha secuencia diana mediante lo cual se determina la presencia de un microorganismo,

(d) donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y

(e) detectar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (d) , mediante lo cual se identifica el microorganismo.

2. El método según la reivindicación 1, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados que hibridan del paso (d) son secuencias diana que proporcionan una señal positiva en el paso (c) .

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dichas moléculas detectoras son una o más sondas detectoras oligonucleotídicas que tienen una secuencia al menos parcialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana que se va a detectar e incluyen una molécula indicadora fluorescente y una molécula extintora fluorescente capaz de extinguir la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación monocatenaria, parcialmente monocatenaria o bicatenaria cuando está sin hibridar donde dicha molécula extintora extingue la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación cuando está

hibridada a dicho ácido nucleico diana donde la fluorescencia de dicha molécula indicadora está sin extinguir.

4. El método según la reivindicación 3, en donde la secuencia de dichas sondas detectoras oligonucleotídicas es al menos complementaria a al menos una región de la primera sonda de ácido nucleico o al menos una región de la segunda sonda de ácido nucleico.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una región detectora DET que es

(i) esencialmente complementaria a una o más sondas detectoras oligonucleotídicas, en donde la una o 65 más sondas detectoras oligonucleotídicas comprende una secuencia cDET complementaria con la región detectora DET, usada para detectar la acumulación de los productos de reacción durante la reacción de amplificación del paso (b5) ;

(ii) esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana; y

(iii) que está localizada entre la secuencia diana y la sección de unión al cebador. 5

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en donde cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y comprende un sitio I y/o II de unión a cebador.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en donde cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y la primera o segunda sonda de ácido nucleico de cada grupo comprende una región identificadora específica.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha región identificadora en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico se localizan entre la secuencia específica de diana y la secuencia de unión al cebador.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha primera sonda de ácido nucleico está acoplada con su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha segunda sonda de ácido nucleico, posiblemente a través de una región de relleno.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho paso de unión (b3) comprende el

uso de una ligasa. 25

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico diana amplificado se marca, preferiblemente durante la amplificación.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha sonda de captura comprende una

región ZIP que es esencialmente complementaria a una región identificadora correspondiente cZIP en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico, o en donde dicha sonda de captura comprende una región cZIP que es esencialmente complementaria a una región identificadora correspondiente ZIP en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde:

(a) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia I de unión a cebador (PBS (I) ) , cZIP y una secuencia I específica de diana (tss (I) ) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia II específica de diana (tss (II) ) , DET y una secuencia II de unión a cebador (PBS (II) ) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(b) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , DET y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) , cZIP y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(c) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cDET y tss (I) , dicha

segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) , cZIP y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(d) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cZIP, DET y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(e) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cZIP, cDET y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(f) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , DET, cZIP y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el 55 cebador I está marcado;

(g) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cDET, cZIP y tss (I) , y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(h) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) y tss (I) , dicha segunda

sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) , DET, cZIP y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(i) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) , cZIP, DET y PBS (II) , y preferiblemente el cebador I está marcado;

(j) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , ZIP y tss (I) , y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) , DET y PBS (II) , y preferiblemente el cebador II está marcado;

(k) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cZIP, DET y tss (I) , dicha

segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador II está marcado;

(l) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , ZIP, cDET y tss (I) , y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador II está marcado;

(m) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , DET, ZIP y tss (I) , dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el cebador II está marcado; y/o (n) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS (I) , cDET, ZIP y tss (I) , y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss (II) y PBS (II) , y preferiblemente el 15 cebador II está marcado.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha sonda de captura es espacialmente direccionable en una micromatriz.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados derivados de al menos dos muestras hibridan a sondas de captura presentes en una única micromatriz.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados hibridados a las correspondientes sondas de captura en una micromatriz producen un patrón de hibridación. 25

17. Uso de al menos un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico como se definen en la reivindicación 1 y/o el uso de al menos un conjunto de dos cebadores como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 12 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

Figura 4