MÉTODO PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE LA FAMILIA ENGRAULIDAE.

La presente invención se refiere a un método para la detección e identificación simultánea en una muestra de al menos una de las especies de la familia Engraulidae seleccionada entre Engraulis encrasicolus,

Engraulis mordax y Engraulis ringens, mediante amplificación por PCR multiplex de al menos una de la secuencias, seleccionada de entre SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, correspondiente con el espaciador no transcrito (NTS) del ADN ribosómico 5S de al menos una de las 3 especies, utilizando al menos uno de los pares de cebadores de secuencia seleccionados entre: SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5; SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7; y SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901649.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CADIZ.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: REBORDINOS GONZALEZ,LAUREANA, CHAIRI,HICHAM.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2376683_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para la detección e identificación de especies de la familia Engraulidae.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en sentido amplio, al análisis genético de diferentes especies de la familia Engraulidae a través de cebadores específicos y en concreto a un método para la detección e identificación simultánea de las especies Engraulis encrasicolus, Engraulis mordax y Engraulis ringens mediante el empleo de técnicas PCR para la amplificación de la secuencia del espacio no transcrito del ADNr 5S.

Antecedentes de la invención

La anchoa o boquerón, Engraulis encrasicolus, es una especie distribuida en el Mediterráneo y en las costas Atlánticas orientales, desde Noruega hasta Angola. Es una especie objetivo de las pesquerías comerciales en España y por ello se ha sometido a sobrepesca, lo que plantea la necesidad de establecer un programa de gestión y conservación de este recurso. Uno de estos programas es la seguridad alimentaria y la trazabilidad de esta especie para evitar cualquier confusión o fraude, sabiendo que se está produciendo un aumento importante de las importaciones de otras especies de boquerón, entre ellas las que proceden del continente americano, para paliar este problema. Estos productos importados pueden ser frescos, congelados o procesados, lo que supone una dificultad añadida para su identificación morfológica.

El creciente interés industrial hacia métodos rápidos ha conducido a la elaboración y aplicación de métodos basados en PCR-multiplex para la detección e identificación de especies utilizadas en elaboración de alimentos, por ejemplo identificación de materia prima a base de bonito (Wen-Feng Lin and Deng-Fwu Hwang "A multiplex PCR assay for species identification of raw and cooked bonito" Food Control 19 (2008) 879-885), detección de la adulteración de las especies de peces en la industria de restaurantes (Asensio L. et al. "Application of multiplex PCR for the identification of grouper meals in the restaurant industry" Food Control 19 (2008) 1096-1099), alimentos a base de carnes (Ghowati S. et al. "Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay" Food Control 20 (2009) 696-699) y también para estudiar la seguridad alimentaria, como la identificación de microbios patógenos en los alimentos (Germini A. et al. "Simultaneous detection of Escherichia coli 0175.H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes by multiplex PCR" Food Control 20 (2009) 733-738) y cereales genéticamente modificados (Forte V. T. et al. "A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize" Food Control 16 (2005) 535-539).

En relación con el boquerón, hasta el momento han sido descritos dos estudios; el primero (Santaclara et al. "Development of a method for genetic identification of four species of anchovies: E. encrasicolus, E. anchoita, E. ringens and E. japonicus". Eur Food Res Technol (2006) 223: 609-614) describe un método para identificar genéticamente 4 especies de la familia Engraulidae: E. encrasicolus, E. anchoita, E. ringens y E. japonicus mediante la técnica PCR-RFLP para la amplificación del Citocromo b del ADN mitocondrial.

El segundo estudio (Rea S. et al. "Species identification in anchovy pastes from the market by PCR-RFLP technique" Food Control 20 (2009), 515-520) trata de identificar las especies utilizadas en alimentos a base de pasta de boquerón mediante PCR-RFLP del Citocromo b del ADN mitocondrial. Las especies estudiadas fueron: E encrasicolus (boquerón), Sardina pilchardus (sardina), Sprattus sprattus (espadín), Alosa fallax (sábalo), Sardinella aurita (alacha), Trachurus trachurus (jurel Atlántico) y Trachurus mediterraneus (jurel Mediterráneo).

Sin embargo, como es bien conocido en el estado de la técnica, el ADN mitocondrial acumula mutaciones, y en caso de que no se estudien todas las secuencias posibles, basta con una mutación puntual en la diana de restricción para que el método no resulte válido. Tal y como se cita en Santaclara et al. "es importante detectar toda la variabilidad intraespecífica de la especie para diseñar un buen método que utilice un gran número de muestras que deben incluir todas las zonas de distribución".

En base a estas limitaciones, los autores de la presente invención, tras una importante labor de investigación, han desarrollado un método que permite detectar e identificar simultáneamente 3 especies de boquerón, una europea (Engraulis encrasicolus) y dos americanas (Engraulis mordax y Engraulis ringens) con una simple técnica, como la PCR multiplex, en un solo paso, que amplifica la secuencia del espaciador no transcrito del ADNr 5S, utilizando cebadores especie-específicos diseñados para este fin y empleando una sola muestra del pez o del producto procesado. Este método permite asegurar la autenticidad de los alimentos a base de boquerón (E. encrasicolus) frente a aquellos a base de otras especies americanas, permitiendo iniciativas como denominaciones de origen.

El nuevo marcador en el que se basa el método desarrollado, el espaciador no transcrito (NTS) de la secuencia del ADNr 5S, no había sido secuenciado hasta el momento para estas especies.

El ADN ribosómico (ADNr) es una secuencia de ADN contenida en los cromosomas del nucléolo que codifica ARN ribosómico. Estas secuencias regulan la transcripción e iniciación de la amplificación. Está formado por numerosas unidades de repetición separadas unas de otras por un espaciador intergénico.

La unidad de repetición del ADNr 5S se compone de una región codificante de 120 pb muy conservada y un espacio no transcrito (NTS) que presenta una gran variabilidad en tamaño y secuencia, lo que hace de éste una herramienta muy útil para comparar especies estrechamente relacionadas.

El empleo del espaciador no transcrito de la secuencia de ADNr 5s como marcador genético para la detección e identificación de estas especies, permite desarrollar un método más rápido y fiable que los anteriormente realizados.

Teniendo en cuenta que el boquerón europeo, E. encrasicolus, pasa por una fase de sobrepesca, las características del método de la invención permiten llevar a cabo la trazabilidad de estas especies de una forma rápida y eficaz, resolviendo así los problemas de errores de etiquetado de productos procesados (fileteado, envasado, etc), así como la venta fraudulenta de las mismas.

Objeto de la invención

En primer lugar, es objeto de la invención un método para la detección e identificación simultánea en una muestra de la presencia o ausencia de al menos una de las especies de la familia Engraulidae, seleccionada entre Engraulis encrasicolus, Engraulis mordax y Engraulis ringens, mediante amplificación por PCR de al menos una de la secuencias correspondiente con el espaciador no transcrito (NTS) del ADN ribosómico 5S de estas tres especies.

Son también objeto de la invención las secuencias del espaciador no transcrito (NTS) del ADN ribosómico de cada una de estas especies, mostradas en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, respectivamente, empleadas como marcador genético para la detección e identificación de las especies citadas.

Son también objeto de la invención cada uno de los cebadores empleados en la amplificación del espaciador no transcrito del ADN ribosómico 5S de cada una de las especies citadas, de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9.

Finalmente, es objeto de la invención un kit para llevar a cabo el método descrito.

Descripción de las figuras

Figura 1: Esquema resumen del proceso de identificación entre las 3 especies de boquerón mediante PCR Múltiplex con cebadores específicos.

Figura 2: Localización de los cebadores específicos (SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5) en la secuencia del NTS del ADNr 5S de E. encrasicolus.

Figura 3: Localización de los cebadores específicos (SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7) en la secuencia del NTS del ADNr 5S de E. mordax.

Figura 4: Localización de los cebadores específicos (SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9) en la secuencia del NTS del ADNr 5S de E. ringens.

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Reivindicaciones:

1. Método para la detección e identificación simultánea en una muestra de al menos una de las especies de la familia Engraulidae seleccionada entre Engraulis encrasicolus, Engraulis mordax y Engraulis ringens, mediante amplificación por PCR de al menos una de la secuencias, seleccionada de entre SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, correspondiente con el espaciador no transcrito (NTS) del ADN ribosómico 5S.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la amplificación se lleva a cabo mediante PCR multiplex.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5, permite la amplificación de un fragmento 599 pb, específico de Engraulis encrasicolus.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7, permite la amplificación de un fragmento de 382 pb, específico de Engraulis mordax.

5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, permite la amplificación de un fragmento de 250 pb, específico de Engraulis ringens.

6. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 4, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis encrasicolus, según el método de la reivindicación 1.

7. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 5, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis encrasicolus, según el método de la reivindicación 1.

8. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 6, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis mordax, según el método de la reivindicación 1.

9. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 7, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis mordax, según el método de la reivindicación 1.

10. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 8, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis ringens, según el método de la reivindicación 1.

11. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 9, para su uso como cebador en la detección e identificación de la especie Engraulis ringens, según el método de la reivindicación 1.

12. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia del espaciador no transcrito del ADN ribosómico 5S de la especie Engraulis encrasicolus mostrada en SEQ ID NO 1.

13. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia del espaciador no transcrito del ADN ribosómico 5S de la especie Engraulis mordax mostrada en SEQ ID NO 2.

14. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia del espaciador no transcrito del ADN ribosómico 5S de la especie Engraulis ringens mostrada en SEQ ID NO 3.

15. Kit para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1-5 que comprende una solución formada por al menos uno de los pares de cebadores seleccionados entre SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5; SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7; y SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9.


 

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