Método de análisis de ácidos nucleicos, que comprende las etapasde fraccionamiento del ácido nucleico,

ligación de adaptadores yamplificación del ácido nucleico y una etapa de transcripción invitro. Dicha invención tiene aplicación en el campo del análisisgenómico de organismos mediante el uso de micromatrices de ADN.

Método de análisis de ácidos nucleicos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el campo de la biología molecular. En particular, la presente invención tiene por objeto un método de análisis de ácidos nucleicos que puede ser utilizado para determinar la presencia de variaciones en el genoma de un organismo, tanto a nivel de alteraciones en la secuencia como de número de copias de un gen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente, una de las técnicas utilizadas para analizar cambios en el número de copias de un gen en un genoma es el método conocido como hibridación genómica comparativa (CGH, comparative genomic hybridization) , que permite detectar grandes cambios cromosómicos que tienen lugar en las células incluyendo la pérdida, duplicación y transubicación de ADN de una célula a otra.

Con el desarrollo de las micromatrices de ADN (también denominadas chips o microarrays de ADN) , éstas han sido rápidamente integradas en los estudios de mapeo genómico, con lo que se obtienen unos mejores niveles de resolución y sensibilidad en el análisis comparativo de ADN genómico y una mayor capacidad de reproducción que permiten la detección fiable de alteraciones a nivel individual en los genes.

Gracias a su versatilidad, la tecnología de micromatrices de ADN presenta aplicaciones en los campos de la transcriptómica, la genética y la epigenética. En este sentido, se han desarrollado distintos protocolos para el marcaje de las muestras de ARN y ADN para poder llevar a cabo análisis masivos en paralelo.

Teóricamente, deberían observarse diferencias en la distribución de las intensidades de señal cuando se lleva a cabo una hibridación con micromatrices de ADN según si la muestra hibridada es ARN o ADN. En una célula, los genes se expresan de forma diferencial por lo que las distintas especies de ARN que se encuentran en una muestra de ARN total pueden presentar diferencias en los niveles de expresión de hasta 4 órdenes de magnitud. En consecuencia, las señales de hibridación de muestras de ARN o aRNA marcadas cubren un rango de intensidades de señal similar (es decir, de unos 4 órdenes de magnitud) para las sondas que se encuentran en la superficie de la micromatriz.

Por contra, aparte del ADN repetitivo o de fragmentos de ADN duplicados o ausentes en muestras individuales, la prevalencia de los diferentes fragmentos de ADN en una muestra de ADN genómico es idéntica, por lo que se esperaría que la variación de la intensidad de la señal entre las distintas sondas de la superficie de la micromatriz fuese sustancialmente menor y que estuviera limitada a pequeñas variaciones en la eficiencia de marcaje de los distintos fragmentos de ADN o a variaciones en la eficiencia de hibridación entre los diferentes fragmentos marcados y las sondas en la superficie de la micromatriz.

Sin embargo, el análisis de la distribución de señales que se obtienen a partir de los distintos protocolos publicados de hibridación de genoma completo o de subgenoma revela que la distribución de las intensidades de señal para las sondas de la superficie de la micromatriz se asemeja a la que se obtiene en los análisis de expresión génica, incluso cuando se tiene un cuidado absoluto en el procedimiento de selección de sondas.

Los protocolos de marcaje que se han utilizado para estudios del genoma incluyen:

- fragmentación del genoma utilizando DNasa I y marcaje en los extremos con transferasa terminal usando UTP marcado (Borevitz et al., 2003. Large-scale identification of single-feature polymorphisms in complex genomes. Genome Research 13:513-523; Winzeler et al., 1998. Direct allelic variation scanning of the yeast genome. Science 281:1194-97) .

- marcaje al azar con cebadores (opcionalmente tras digestión con un enzima de restricción para generar fragmentos más pequeños) utilizando dNTPs marcados (Pollack et al., 1999. Genome-wide analysis of ADN copy-number changes using cDNA microarrays. Nature Genetics 23: 41-46) .

- amplificación subgenómica mediante digestión con uno o varios enzimas de restricción, ligación de un adaptador y amplificación utilizando cebadores basados en el adaptador, seguido del marcaje en los extremos con transferasa terminal usando UTP marcado (Maitra et al., 2005. Genomic alterations in cultured human embr y onic stem cells. Nature Genetics 37 (10) : 1099-1103) .

- amplificación subgenómica mediante digestión con uno o varios enzimas de restricción, ligación de un adaptador y amplificación utilizando cebadores marcados en un extremo basados en el adaptador.

Todos estos protocolos generan señales distribuidas sobre 3-4 órdenes de magnitud, es decir, en el rango de detección total de los escáneres utilizados actualmente. Hasta el momento se desconocen los motivos por los cuales se produce esta distribución en las intensidades de señal, aunque esta variación no se puede explicar completamente por el método de marcaje, por diferencias en las características termodinámicas de las sondas sobre la superficie, o por variaciones en el proceso de escaneado y, por lo tanto, deben ser causadas por desviaciones producidas en el método de marcaje.

WO0028081 describe un procedimiento para la detección de polimorfismos en el que se usa al menos un enzima de restricción para generar fragmentos de restricción a partir de ADN genómico. Posteriormente, se ligan segmentos adaptadores a los extremos de los fragmentos de restricción y los fragmentos se amplifican usando amplificación dirigida por cebador (“primer-directed amplification”) en la que los cebadores para la amplificación se encuentran marcados. Los fragmentos resultantes se hibridan a un bioarray para la identificación posterior de variantes potenciales, esto último revelando los polimorfismos / SNPs potenciales presentes en la muestra.

WO03016483 describe la introducción de etiquetas durante la transcripción del ARN sin describir, sin embargo, el efecto beneficioso y las ventajas concretas encontradas en la invención subyacente en el contexto del análisis de variaciones genómicas. Por este motivo, se han hecho algunos intentos para mejorar el método de marcaje encaminados a disminuir la amplitud del rango de intensidades de señal (Lieu et al., 2005. Development of a DNA-labeling system for array based comparative genomic hybridization. J. Biom. Tech. 16:104-111) .

La distribución de las intensidades de señal en un rango amplio tiene varias consecuencias en la práctica:

- dado que la relación señal/ruido de fondo empeora en el rango más bajo de señal, una fracción de las señales pierde calidad para el análisis. La intensidad de señal en el extremo inferior del espectro puede mejorarse añadiendo (hasta un cierto límite) más ADN marcado, pero esto hace que las señales más altas se muevan hacia la saturación y se pierda la capacidad cuantitativa para estos puntos.

- para algunas aplicaciones, incluyendo el mapeo de ADN, es deseable poder llevar a cabo análisis masivos de muestras de ADN, de forma que en lugar de realizar el análisis de una única muestra en comparación con un control, el análisis se realiza sobre una mezcla de varias muestras de tal manera que el nivel de hibridación en la mezcla refleja, en comparación con una muestra referencia positiva y con una muestra referencia negativa, la frecuencia de la presencia de una señal en la muestra que contiene la mezcla. Típicamente, sería deseable poder detectar una señal que reflejase una dilución de cien veces de la señal de la muestra referencia positiva. Si, por ejemplo, las señales detectables se encuentran en el rango entre 60 y 60000, la señal de referencia positiva debería alcanzar un valor de al menos 6000, y la muestra referencia negativa debería tener un valor residual claramente por debajo de 60. Para estas aplicaciones, todas las intensidades de señal deberían estar comprendidas entre 100 veces la señal mínima claramente detectable y las señales detectables más altas dentro del rango lineal del escáner. Utilizando los protocolos actuales de marcaje de ADN, este criterio elimina la mayoría de las sondas, porque hay relativamente pocas sondas con una intensidad mayor que 100 veces el ruido de fondo.

- para otras aplicaciones, incluyendo el análisis de las variaciones en el número de copias de un gen (como por ejemplo la CGH) , es deseable... [Seguir leyendo]

1. Método de análisis de ácidos nucleicos para el estudio de variaciones en el genoma, que comprende las etapas:

a) fragmentación de una muestra de ADN genómico,

b) ligación, en los extremos de los fragmentos de ADN obtenidos, de adaptadores específicos compatibles con los extremos generados donde al menos uno de los adaptadores ligados contiene una secuencia promotora funcional,

c) amplificación de los fragmentos obtenidos utilizando cebadores específicos basados en los adaptadores,

d) transcripción in vitro de los fragmentos de ADN amplificados con una ARN polimerasa capaz de iniciar la transcripción a partir de la secuencia promotora contenida en los adaptadores utilizando una mezcla de nucleótidos (rNTPs) ,

e) hibridación con los oligonucleótidos de la micromatriz de ADN y detección de los fragmentos hibridados mediante la detección de un marcaje incorporado durante la etapa d) en los fragmentos a analizar mediante la incorporación de análogos de nucleótidos que contienen marcajes detectables directamente, análogos de nucleótidos que incorporan marcajes que pueden ser visualizados indirectamente en una reacción posterior, o cualquier otro tipo de marcaje de ácidos nucleicos directo o indirecto, y

f) comparación cuantitativa de las señales de diferentes muestras analizadas.

2. Método según la reivindicación 1, en el cual la muestra de ADN analizada es una muestra de ADN genómico aislada a partir de cualquier organismo en el que se desee estudiar la presencia de variaciones en el genoma.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual la fragmentación de una muestra de ADN genómico se lleva a cabo por métodos químicos, métodos físicos o métodos enzimáticos.

4. Método según la reivindicación 3, en el cual la fragmentación de una muestra de ADN genómico se realiza mediante digestión con al menos un enzima de restricción, preferentemente mediante digestión con dos enzimas de restricción.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual las micromatrices de ADN sobre las que se lleva a cabo la hibridación y detección están constituidas por una colección de múltiples oligonucleótidos inmovilizados sobre un sustrato sólido, donde cada oligonucleótido está inmovilizado en una posición conocida de forma que la hibridación con cada uno de los múltiples oligonucleótidos se puede detectar por separado, donde el sustrato puede ser compacto o poroso, plano o no plano, unitario o distribuido, y donde las micromatrices de ADN pueden ser elaboradas con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.

6. Método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos análogos de nucleótidos contienen fluóforos como marcajes detectables directamente, o biotina o haptenos como marcajes que pueden ser visualizados indirectamente en una reacción posterior.

7. Método según la reivindicación 6, donde dicho análogo de nucleótido que contiene el marcaje es Cy3-UTP, Cy5-UTP o fluoresceína-UTP para el marcaje directo o biotina-UTP para el marcaje indirecto.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual dicha detección de los fragmentos hibridados se lleva a cabo a partir de la cuantificación directa de la cantidad de muestra hibridada sobre las sondas de ADN contenidas en la micromatriz de ADN, donde dicha cuantificación directa se puede llevar a cabo mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, microscopía de fuerza atómica (AFM) , microscopía de efecto tunel (STM) o microscopía electrónica de barrido (SEM) ; métodos electroquímicos, como medida de impedancia, voltaje o amperaje, o métodos ópticos, como microscopía confocal y no confocal, microscopía de infrarrojos, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia o transmitancia.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicha ARN polimerasa que se utiliza en la etapa de transcripción in vitro se elige del grupo que incluye, pero no se limita a, T7 ARN polimerasa, T3 ARN polimerasa y SP6 ARN polimerasa.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual se cumple el requisito de que la relación entre la dispersión relativa de las intensidades de señal de las sondas de la muestra respecto a la dispersión relativa de

las intensidades de señal de los controles es menor que 4, preferentemente menor que 3, más preferentemente menor que 2, aún más preferentemente menor que 1, 5.

Fig. 1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citada en la descripción