MÉTODO COMBINADO PARA LA MEDICIÓN SECUENCIAL DE (1) LA FRACCIÓN ENZIMÁTICAMENTE ACTIVA Y (2) LA CANTIDAD TOTAL DE UNA ENZIMA.

Método in vitro para la medición secuencial de, en primer lugar,

la fracción enzimáticamente activa y, en segundo lugar, la cantidad total de una enzima (1) en la misma muestra biológica compleja, siendo dicho método una combinación de una extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática, o método SIEFED, y de un inmunoensayo enzimático, o método ELISA, caracterizado por que este método por «SIEFED- ELISA combinados» se realiza en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo primario (2) o la misma porción hipervariable de anticuerpo primario, siendo ambos específicos contra dicha enzima y estando fijados en la superficie del soporte sólido (3)

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método combinado para la medición secuencial de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima [(tal como la mieloperoxidasa (MPO)] en una muestra, y que mejora sus aplicaciones en los campos de la salud veterinaria y humana. 5 Antecedentes de la invención La solicitud de patente internacional WO2005/07586 describe un método y un kit para medir la activación de los neutrófilos. Este método se basa en un método de detección por ELISA o por SIEFED y en en un kit para medir el estado de activación de los neutrófilos en una muestra biológica obtenida de un mamífero, preferentemente un 10 caballo. Este método se podría utilizar para detectar y/o predecir enfermedades o afecciones, para seguir la activación de los neutrófilos durante el tratamiento de un mamífero enfermo, para evaluar la capacidad de los neutrófilos durante su lucha contra los microorganismos y/o su destrucción, para evaluar la eficacia de los inmunomoduladores (o la capacidad inhibidora in vitro de los fármacos) mediante la comparación del estado de 15 activación de los neutrófilos entre los neutrófilos tratados y sin tratar, para evaluar la capacidad de los neutrófilos tratados con dicho modulador y/o fármaco para luchar contra los microorganismos y/o para destruirlos, para evaluar la capacidad de defensa natural o la capacidad de un mamífero para luchar contra microorganismos y para detectar o seleccionar compuestos que interaccionan con la mieloperoxidasa (MPO). La solicitud de patente internacional WO2005/07586 describe también el uso de los métodos ELISA y 20 SIEFED y los kits para distinguir entre la mieloperoxidasa total y la mieloperoxidasa activa (contenido de MPO). No obstante, este documento no describe y no sugiere que la detección de la MPO se pueda obtener mediante estos métodos en un bioensayo o método combinado en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo de unión o porción de anticuerpo. Objetivos de la invención 25 La presente invención se propone dar a conocer un método que no presenta los inconvenientes del estado de la técnica y que permite medir la fracción activa y la cantidad total de una enzima en la misma muestra, de modo secuencial con el mismo anticuerpo primario sobre el mismo soporte sólido. Un objetivo principal de la presente invención es dar a conocer un método que se utilice para la medición combinada de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de los diferentes tipos de las enzimas que están 30 implicadas en diferentes enfermedades, tales como enfermedades cardíacas y cáncer, preferentemente enzimas que están implicadas en la arterioesclerosis. Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer tal método de detección que reduce los retrasos de detección y la cantidad de mezclas reactivas utilizadas (especialmente la cantidad de anticuerpos primarios utilizados, la cantidad de soporte sólido utilizado, la cantidad de enzima purificada para obtener la curva de 35 calibración). Un último objetivo de la presente invención es proponer tal método que permita la automatización de este método, particularmente al permitir la medición simultánea de la activación de la fracción activa y la cantidad total de los diferentes tipos de enzimas, posiblemente presentes a la vez en la misma muestra biológica. Definiciones 40 El acrónimo ELISA significa «inmunoensayo enzimático» y el acrónimo SIEFED significa «Extracción inmunitaria específica seguida de detección enzimática». «Una medición secuencial de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima presente en una muestra biológica» significa una método de detección que, después de unir la enzima sobre el anticuerpo primario inmovilizado, permite medir la fracción enzimáticamente activa de una enzima (a saber, la detección se 45 realiza sobre la enzima activa mediante la medición de su actividad enzimática con la adición de sustrato y cosustrato adecuados) seguida de la medición de la cantidad total de la enzima que se aplica sobre la enzima activa o inactiva. Una «medición» significa una detección y, si llega el caso, una cuantificación. La terminología «un inhibidor enzimático» significa un compuesto o agente que se une a una enzima de tal modo que impide la unión normal entre el sustrato y la enzima, y la reacción catalítica. 50 Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un método combinado para la medición secuencial de la fracción

enzimáticamente activa y la cantidad total (cantidad activa y, si llega el caso, inactiva) de una enzima presente en una muestra biológica, que se basa en un bioensayo y método de detección por SIEFED-ELISA combinados; tal detección se realiza después de capturar la enzima (activa e inactiva) con el mismo anticuerpo primario fijado sobre el mismo soporte sólido (superficie), estando dirigido este anticuerpo primario contra esta enzima. Los inventores han descubierto inesperadamente que estos dos métodos (método por SIEFED-ELISA) (que parecen ser 5 antagonistas el uno del otro) se pueden simultanear eficazmente y pueden permitir una calibración eficaz con la misma curva de calibración o estándar con el uso del mismo anticuerpo primario fijado a un soporte sólido. Además, los inventores han observado inesperadamente que el mismo anticuerpo primario fijado al mismo soporte sólido se podría utilizar en estas dos etapas combinadas. De hecho, los inventores han observado inesperadamente que el anticuerpo primario fijado a un soporte sólido no resulta afectado por ninguna etapa de lavado utilizada durante los 10 dos métodos y que se podría mantener sobre el soporte sólido con su enzima unida. Como la técnica secuencial para la mieloperoxidasa (el método por SIEFED seguido por el ELISA) se realiza con el mismo recubrimiento de anticuerpos primarios de una placa multipocillo, el método de la invención - permite economizar los anticuerpos primarios, - permite economizar el soporte sólido (placa multipocillo), 15 - permite economizar la proteína pura de referencia (mieloperoxidasa) utilizada para establecer las curvas estándares (de referencia), - permite ahorrar tiempo: se necesita sólo una dilución de las muestras y solo un reparto de muestras en los pocillos. Además, el método de la invención 20 - permite economizar los reactivos (tampón de dilución). - asegura un mayor nivel de precisión en la medición de la mieloperoxidasa mediante SIEFED y mediante ELISA para una misma muestra (los anticuerpos primarios y la referencia o la muestra desconocida son idénticos para las dos mediciones, lo que descarta las variaciones debidas a alguna pequeña diferencia en la concentración de los anticuerpos en el volumen de la muestra a medir). 25 - esta característica es importante para establecer una proporción de MPO total por MPO activa para una muestra determinada. El método según la invención es un método in vitro para la medición secuencial (mediante etapas consecutivas) de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una o más enzima(s), preferentemente mieloperoxidasa (MPO), comprendiendo este método las etapas consecutivas siguientes: 30 1) proporcionar una muestra biológica, preferentemente una muestra biológica obtenida de un mamífero, tal como un caballo o un humano, conteniendo dicha muestra la(s) mencionada(s) enzima(s) [o células que pueden liberar la(s) mencionada(s) enzima(s)], 2) inmunocapturar dicha(s) enzima(s), presente(s) en la muestra biológica, mediante un anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) específico de enzima o la porción hipervariable del mismo, siendo ambos específicos 35 contra esta(s) enzima(s) y estando fijados a la superficie de un soporte sólido, 3) si llega el caso, retirar mediante una (primera) etapa de lavado cualquier compuesto que interfiera con la medición de la actividad de la enzima inmunocapturada por este anticuerpo primario (o su porción), 4) obtener un valor de la actividad de la enzima medida a partir de una detección y cuantificación por SIEFED mediante detección y/o medición de la actividad enzimática, preferentemente con la adición de un sustrato 40 específico que será transformado por esta enzima en un producto de reacción visible (preferentemente un fluorescente), 5) si llega el caso, comparar dicho valor de actividad enzimática medida con un valor de actividad enzimática normal (a saber, valores [niveles] enzimáticos estándares de referencia o estándares preestablecidos utilizados como referencia) obtenido de un número significativo (más de 10, preferentemente más de 50, más 45 preferentemente más de 200 o 1000 individuos) de mamíferos «sanos», preferentemente caballos o humanos (a saber, mamíferos...

1. Método in vitro para la medición secuencial de, en primer lugar, la fracción enzimáticamente activa y, en segundo lugar, la cantidad total de una enzima (1) en la misma muestra biológica compleja, siendo dicho método una combinación de una extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática, o método 5 SIEFED, y de un inmunoensayo enzimático, o método ELISA, caracterizado por que este método por «SIEFED-ELISA combinados» se realiza en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo primario (2) o la misma porción hipervariable de anticuerpo primario, siendo ambos específicos contra dicha enzima y estando fijados en la superficie del soporte sólido (3). 2. Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas sucesivas de: 10

1) inmunocapturar una enzima (1) presente en una muestra biológica obtenida de un mamífero, conteniendo dicha muestra la enzima (1) o las células capaces de liberar dicha enzima, mediante un anticuerpo primario monoclonal o policlonal específico (2) o una porción hipervariable del mismo, siendo ambos específicos de dicha enzima (1) y estando fijados a una superficie de soporte sólido (3), 15

2) retirar mediante una primera etapa de lavado cualquier compuesto que interfiera con la medición de la actividad enzimática de la enzima inmunocapturada en la superficie del soporte sólido (3) mediante el anticuerpo primario (2) o una porción de él,

3) obtener un valor de actividad enzimática medido mediante detección y cuantificación por SIEFED al detectar y medir la actividad de la enzima (1) inmunocapturada, 20

4) si llega el caso, comparar el valor de dicha actividad enzimática medida con los valores de actividad enzimática normal obtenidos de un número significativo de mamíferos sanos

5) y opcionalmente cuantificar el valor de actividad enzimática mediante una curva estándar de la enzima,

6) retirar mediante una segunda etapa de lavado cualquier sustrato y compuesto utilizado para la 25 detección en las etapas de SIEFED, o que se obtienen de las mismas, y presente en la disolución con la enzima inmunocapturada (1),

7) obtener mediante detección por ELISA la cantidad de enzima total medida por detección y medición de la cantidad total activa e inactiva de enzima (1) presente en una muestra biológica, mediante la adición de un anticuerpo secundario monoclonal o policlonal (4) o una porción del 30 mismo, para la detección de la enzima (1) inmunocapturada por dicho anticuerpo primario (2) o una porción del mismo,

8) si llega el caso, comparar dicha cantidad total de enzima medida con la cantidad de enzima total normal obtenida a partir de un número significativo de mamíferos sanos,

9) opcionalmente, cuantificar la cantidad de enzima total mediante la curva estándar de la enzima y, 35 si llega el caso, relacionar la cantidad de enzima total medida con un estado de activación de la célula que libera la enzima en relación con la presencia, ausencia o condición de una enfermedad o un estado inmunológico,

10) si llega el caso, calcular la proporción de la enzima total por la enzima activa en una muestra biológica y comparar esta proporción con una proporción normal obtenida a partir de un número 40 significativo de mamíferos sanos, o relacionar esta proporción con un estado de activación de la enzima asociada a una condición patológica.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la etapa de obtener una detección y cuantificación por SIEFED mediante la detección y la medición de la actividad enzimática se realiza añadiendo un sustrato específico (8) destinado a ser transformado por la enzima (1) en un producto de reacción visible. 45 4. Método según la reivindicación 3, en el que el producto de reacción visible es un producto de reacción fluorescente. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica se obtiene de un mamífero. 6. Método según la reivindicación 5, en el que el mamífero es un caballo o un ser humano. 50 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima se selecciona entre el grupo que consiste en mieloperoxidasa, proteasas, NADPH oxidasa, glutatión peroxidasa, NO sintasa, catalasa o colagenasas. 8. Método según la reivindicación 7, en el que la proteasa es tripsina o elastasa.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el soporte sólido (3) es una placa multipocillo. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo secundario (4) está marcado. 11. Método según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo secundario (4) está marcado por 5 conjugación a una enzima.