Método y aparato para determinar los índices de células sanguíneas rojas en una muestra de sangre utilizando la pigmentación intrínseca de la hemoglobina contenida en las células sanguíneas rojas.

Un método para determinar un volumen de células de una célula sanguínea roja dentro de una muestra de sangre,

que comprende las etapas de:

depositar la muestra de sangre en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12), y una superficie interior (18) de un segundo panel (16), donde ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16), cuya altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja (22) dentro de la muestra está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18);

captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja (22) que está en contacto con las superficies interiores (14,18); incluyendo una parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14,18) y una parte que no está en contacto con ambas superficies interiores (14,18);

determinar una densidad óptica de la parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y una densidad óptica de la parte que no está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) con un criterio por unidad de imagen; y

determinar el volumen de célula de la célula sanguínea roja (22) usando la densidad óptica determinada de la parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes en contacto con ambas superficies interiores (14, 18), y la densidad óptica determinada de la parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes que no está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18),

Método y aparato para determinar los índices de células sanguíneas rojas en una muestra de sangre utilizando la pigmentación intrínseca de la hemoglobina contenida en las células sanguíneas rojas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo técnico La presente invención se refiere aparatos y métodos para el análisis de muestras de sangre en general, y para la determinación del volumen de una célula sanguínea roja así como del volumen medio de células de una muestra en particular.

2. Información de los antecedentes El documento WO 99/44593 A describe el análisis de muestras de sangre entera anticoagulada quiescente.

Médicos, veterinarios y científicos han examinado fluidos biológicos de humanos y animales, especialmente sangre, para determinar sus cantidades de partículas constituyentes así como para identificar la presencia de partículas inusuales no vistas en sujetos saludables. Las partículas generalmente medidas, cuantificadas e identificadas incluyen células sanguíneas rojas (RBC) , células sanguíneas blancas (WBC) y plaquetas. Los análisis de RBC pueden incluir determinaciones del número, tamaño volumen, forma, contenido y concentración de hemoglobina de RBC, y el hematocrito (también denominado el volumen relleno de células) . Los análisis de RBC pueden implicar también la determinación de la presencia y/o concentración de ciertos componentes dentro de las células sanguíneas rojas tales como ADN, ARN, incluyendo la detección de la presencia y/o enumeración de hematoparásitos (por ejemplo parásitos de la malaria) o bien en las RBC o tripanosomas que son extracelulares u organismos de leismaniasis que están en las WBC así como muchos otros hematoparásitos. Los análisis de WBC pueden incluir una determinación de la frecuencia de población de subtipos de WBC denominado generalmente un recuento de WBC diferencial, así como la notificación de cualquier tipo de célula inusual no encontrada en individuos saludables. Los análisis de plaquetas (o en cientos animales que incluyen pájaros, reptiles y peces, trombocitos que tienen una función similar a la de las plaquetas en los mamíferos pero que son aproximadamente diez veces más grandes y están nucleados) pueden incluir el número, tamaño, forma, textura de las plaquetas y determinaciones volumétricas, incluyendo la determinación de la presencia de aglomeraciones de plaquetas o trombocitos dentro de la muestra.

Las técnicas de examen de sangre conocidas, descritas con detalle en textos médicos tales como Wintrobe’s Clinical Hematology 12ª Edición, generalmente dividen los métodos de examen en métodos de tipo manuales, de centrifugado y de impedancia. Los métodos manuales para la enumeración de células implican típicamente la creación de un volumen determinado con exactitud de una muestra de sangre o fluido que está cuantitativamente diluida y recontada visualmente en una cámara de recuento. Los métodos de examen manual incluyen examinar un frotis periférico en el que se determinan las cantidades relativas de los tipos de partículas mediante inspección visual. Los métodos de examen de centrifugado incluyen el centrifugado de la muestra, causando la separación de la muestra en capas de constituyentes según las densidades relativas de dichos constituyentes. Se puede teñir cada capa de componente para mejorar la visibilidad o detección. Los métodos de impedancia implican el examen de un volumen exacto de sangre que se trata según las partículas que se van a medir, por ejemplo, lisando RBC para la enumeración de las células nucleadas y diluyendo volumétricamente la muestra en un fluido conductor. El procedimiento implica típicamente monitorizar una corriente o voltaje aplicado a la muestra que pasa a través de un paso estrecho para determinar el efecto que las partículas tienen sobre la corriente/voltaje a medida que las partículas pasan a través en una única fila. Otras técnicas implican analizar la intensidad y ángulo de dispersión de luz incidente para las partículas que pasan en una única fila a través de un haz de luz. Se pueden usar también métodos citométricos de flujo que implican teñir las partículas de interés en suspensión con fluoróforos, unidos a anticuerpos dirigidos contra epítopos superficiales presentes en células o tipos de partículas, excitar las partículas teñidas con luz de longitudes de onda apropiadas, y analizar la emisión de las partículas/células individuales.

Todos los métodos mencionados anteriormente, aparte del frotis periférico o la separación centrífuga, requieren dispensar un volumen exacto de muestra. Las imprecisiones en el volumen de muestra darán lugar a errores cuantitativos de la misma magnitud en el análisis asociado. Con excepción de los métodos de centrifugado, todos los métodos mencionados anteriormente requieren también que la muestra se mezcle con un o más reactivos o diluyentes líquidos, y también requieren la calibración del instrumento para obtener resultados exactos. En el caso de los frotis periféricos, se necesita un alto grado de capacitación para examinar apropiadamente el frotis. Varios de los métodos anteriormente mencionados generan grandes volúmenes de residuos contaminados que resultan caros de manejar. Además, los métodos descritos anteriormente no son adecuados para determinar el recuento de sangre completo (CBC) en pájaros, reptiles y peces en los que las células sanguíneas rojas y trombocitos están nucleados y ciertos mamíferos en los que el tamaño de las células sanguíneas rojas es muy pequeño y se puede confundir con las plaquetas.

La cantidad de información que se puede determinar examinando la sangre de un humano o de un animal es enorme. Es particularmente útil para determinar los índices de RBS, por ejemplo, tamaño de células individuales,

contenido y concentración de hemoglobina en células individuales y estadísticas de población de RBC dentro de una muestra. Los valores estadísticos medios y de dispersión (por ejemplo coeficientes de variación) para cada uno de los parámetros anteriormente mencionados pueden proporcionar una importante información, como resulta evidente de su discusión dentro de el texto anteriormente referenciado de Wintrobe, el cual ha permitido a los médicos catalogar mejor los trastornos de RBC.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar un volumen de célula de una célula sanguínea roja dentro de una muestra de sangre, según las reivindicaciones 1 a 13.

Los métodos pueden comprender las etapas de: determinar el volumen de células para una pluralidad de células sanguíneas rojas en contacto con ambas superficies interiores; y determinar un volumen medio de células usando el volumen de células determinado por cada pluralidad de células sanguíneas rojas. Se pueden captar imágenes de la muestra entera.

Los métodos pueden comprender además la etapa de mezclar un agente de formación de esferas isovolumétricas con al menos una parte de la muestra. El agente de formación de esferas isovolumétricas puede ser un detergente anfótero.

Las superficies interiores de los paneles pueden ser sustancialmente paralelos, y se puede conocer la altura de la cámara antes de la determinación del volumen de células. La altura de la cámara puede estar dentro del intervalo de aproximadamente dos micrómetros a seis micrómetros.

Los métodos pueden comprender además las etapas de: captar imágenes de una pluralidad de células sanguíneas rojas dentro de la muestra, teniendo cada una una parte en contacto con ambas superficies interiores; determinar para cada célula sanguínea roja una densidad óptica de la parte de esa célula sanguínea roja en contacto con ambas superficies interiores con un criterio por unidad de imagen; y determinar un valor medio de la densidad óptica máxima usando la densidad óptica determinada para la parte de cada pluralidad de células sanguíneas rojas en contacto con ambas superficies interiores.

Los métodos pueden comprender además las etapas de: captar imágenes de una o más células sanguíneas rojas que no están en contacto con ambas superficies interiores; determinar una densidad óptica de las células sanguíneas rojas que no están en contacto con ambas superficies interiores; determinar un volumen de células para una o más células sanguíneas rojas que no están en contacto con ambas superficies interiores, usando la densidad óptica de esa célula sanguínea roja, el valor medio determinado de la densidad óptica máxima, y la altura de la cámara.

La muestra puede tener una primera parte mezclada con un agente de formación de esferas isovolumétricas y una segunda parte libre de agente... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar un volumen de células de una célula sanguínea roja dentro de una muestra de sangre, que comprende las etapas de:

depositar la muestra de sangre en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , donde ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , cuya altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja (22) dentro de la muestra está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja (22) que está en contacto con las superficies interiores (14, 18) ; incluyendo una parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y una parte que no está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

determinar una densidad óptica de la parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y una densidad óptica de la parte que no está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) con un criterio por unidad de imagen; y

determinar el volumen de célula de la célula sanguínea roja (22) usando la densidad óptica determinada de la parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , y la densidad óptica determinada de la parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes que no está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ,

2. El método de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

determinar el volumen de células para una pluralidad de células sanguíneas rojas (22) en contacto con ambas superficies interiores; y

determinar un volumen medio de células usando el volumen de células determinado para cada pluralidad de células sanguíneas rojas (22) .

3. El método de la reivindicación 1, en el que se obtienen imágenes de toda la muestra.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar un agente de formación de esferas isovolumétricas con al menos una parte de la muestra.

5. El método de la reivindicación 1, en el que las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) son sustancialmente paralelas, y la altura de la cámara (20) se conoce antes de la determinación del volumen de células.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la altura de la cámara (20) está dentro del intervalo de aproximadamente dos micrómetros a seis micrómetros.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

captar imágenes de una pluralidad de células sanguíneas rojas (22) dentro de la muestra, teniendo cada una una parte en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

determinar para cada célula sanguínea roja (22) , una densidad óptica de la parte de esa célula sanguínea roja que está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) con un criterio por unidad de imagen; y

determinar un valor medio de la densidad óptica máxima usando la densidad óptica determinada para la parte de cada pluralidad de células sanguíneas rojas (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) .

8. El método de la reivindicación 7, que comprende además las etapas de:

captar imágenes de una o más células sanguíneas rojas (22) que no están en contacto con las superficies interiores (14, 18) ,

determinar una densidad óptica de las células sanguíneas rojas (22) que no están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

determinar un volumen de células para una o más células sanguíneas rojas (22) que no están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , usando la densidad óptica de esa célula sanguínea roja (22) , el valor medio determinado de la densidad óptica máxima, y la altura (20) de la cámara (10) .

9. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar un colorante supravital con la muestra, el cual es operable para producir reticulina dentro de reticulocitos dentro de la muestra para emitir radiación fluorescente cuando se excita por luz de una o más longitudes de onda predeterminadas.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende además la etapa de determinar una cantidad relativa de reticulina dentro de un o más reticulocitos fluorescentes.

11. El método de la reivindicación 9, que comprende además las etapas de:

captar imágenes de una pluralidad de células sanguíneas rojas (22) , estando al menos una parte de cada célula sanguínea roja (22) en contacto con las superficies internas (14, 18) , donde la captación de imágenes se realiza usando luz que es absorbida por la hemoglobina dispuesta dentro de las células sanguíneas rojas (22) ;

captar imágenes de la pluralidad de células sanguíneas rojas (22) a las longitudes de onda predeterminadas operables para producir reticulina dispuesta dentro de los reticulocitos dentro de la muestra para emitir radiación fluorescente;

determinar el volumen de células para cada pluralidad de células sanguíneas rojas (22) ; y

determinar un volumen medio de células usado el volumen de células para cada pluralidad de células sanguíneas rojas (22) , excluyendo del volumen medio de células el volumen de cada célula sanguínea roja (22) que emite radiación fluorescente.

12. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

determinar la concentración de hemoglobina de la célula sanguínea roja (22) , usando la densidad óptica determinada para la parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ; y

determinar el contenido de hemoglobina dentro de la célula sanguínea roja (22) usando la concentración de hemoglobina y el volumen de células.

13. Un método para determinar un volumen de células de una célula sanguíneas roja dentro de una muestra de sangre que comprende las etapas de:

depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , donde ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , cuya altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja (22) dentro de la muestra está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja (22) que está en contacto con las superficies interiores (14, 18) , y producir señales de imágenes;

determinar un valor de densidad óptica para una parte de la célula sanguínea roja (22) en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , y una densidad óptica total de la célula sanguínea roja (22) , ambas con un criterio por unidad de imagen; y

determinar un volumen de la célula sanguínea roja (22) de la que se han captado imágenes usando el valor de densidad óptica para la parte de la célula en contacto las superficies interiores (14, 18) , la densidad óptica total, y la altura (20) de la cámara (10) .

14. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la muestra de sangre no está sustancialmente diluida.

15. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la unidad de imagen es un pixel.

16. Un aparato para determinar un volumen de células de al menos una célula sanguínea roja dentro de una muestra de sangre sustancialmente no diluida, que comprende:

una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , donde ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , cuya altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja (22) está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

una unidad de captación de imágenes que incluye un iluminador (46) y un disector de imágenes (48) , siendo dicha unidad operable para captar imágenes de la menos una célula sanguínea roja (22) que está en contacto con las superficies interiores (14, 18) , y producir señales de imágenes representativas de dicha célula sanguínea roja (22) de la que se han captado imágenes, y un analizador programable (50) adaptado para determinar, usando las señales de imágenes, un valor de densidad óptica de al menos una célula sanguínea roja (22) que está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y una densidad óptica total de la célula sanguínea roja (22) , y un volumen de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes (22) usando la densidad óptica, la densidad óptica total, y la altura (20) de la cámara (10) .

Determinar la concentración de hemoglobina para una pluralidad de células sanguíneas rojas y/o agregados y determinar la concentración media de hemoglobina a partir de la pluralidad de concentraciones de hemoglobina determinadas.

FIG. 10

Depositar una muestra de sangre en la cámara de análisis Determinar la densidad óptica media de una parte de la célula sanguínea roja en contacto con los paneles y la densidad óptica total de la célula sanguínea roja.

Determinar el volumen de la célula sanguínea roja usando la densidad óptica media de la parte de la célula en contacto con los paneles, la densidad óptica total, y la altura de la cámara.

FIG. 11

Determinar el contenido de hemoglobina para una célula sanguínea roja integrando la concentración de hemoglobina determinada en el volumen determinado de la célula sanguínea roja Determinar el contenido medio de hemoglobina determinando el contenido de hemoglobina para una población de células sanguíneas rojas individuales y determinar el valor medio a partir de los valores individuales del contenido de hemoglobina.

FIG. 12