METODO DE ANALISIS CITOMETRICO DE FLUJO, SIMULTANEO Y CUANTITATIVO,

PARA DETERMINAR LOS GLOBULOS ROJOS NUCLEADOS (NRBC), LOS GLOBULOS BLANCOS (WBC), LOS WBC DAÑADOS Y UN DIFERENCIAL WBC (DIF./WBC) UTILIZANDO LOGICA Y/O DE TRIPLE DISPARADOR

Método para el análisis simultáneo de viabilidad celular, diferencial de glóbulos rojos nucleados y glóbulos blancos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a un método para el análisis simultáneo y cuantitativo de glóbulos blancos (WBC) dañados, glóbulos rojos nucleados (NRBC) y subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC/Diff). Más particularmente esta invención se refiere a la diferenciación de WBC, NRBC, WBC dañados y un diferencial de subclase MBC (WBC/Diff) en una muestra sanguínea total mediante el uso de análisis de fluorescencia y dispersión de luz multidimensional y un reactivo de lisis capaz de lisar glóbulos rojos (RBC) sin dañar las membranas celulares de WBC.

Los recuentos de NRBC se determinan convencionalmente por medio de la morfología de frotis sanguíneo. Un frotis sanguíneo teñido se examina en el microscopio y los NRBC se cuentan manualmente. En general, una concentración de NRBC se indica como el número de NRBC por 100 glóbulos blancos ("WBC"). Normalmente, se cuentan 200 WBC y el número de NRBC presente en la misma región de un frotis sanguíneo de paciente y se dividen los números por 2 para expresar la concentración de NRBC como el número de NRBC/100 WBC. El inconveniente principal de este tipo de método microscópico manual es que es un trabajo muy intensivo, que consume mucho tiempo, subjetivo e impreciso debido a las estadísticas pobres. Por lo tanto, patólogos y técnicos de laboratorio han buscado durante mucho tiempo un método automatizado preciso para los NRBC.

Un problema principal en la automatización de un método para NRBC para su uso en citómetro de flujo clínico ha sido que puesto que los NRBC se dan en casos excepcionales y las poblaciones de RBC son tan numerosas, las poblaciones de NRBC no se detectan fácilmente entre la población glóbulos rojos ("RBC") bien mediante las diferencias en la resistividad eléctrica celular (medidas de impedancia) o por sus características de dispersión de luz (medidas ópticas). Aunque se han hecho muchos intentos para contar los NRBC entre las poblaciones de WBC, en lugar de entre la población de RBC, estos esfuerzos generalmente no han tenido éxito.

Las poblaciones de NRBC no se distinguen fácilmente de las poblaciones WBC puesto que los NRBC no forman un grupo bien definido entre los WBC en los métodos habituales de diferenciación espacial bidimensional utilizados en los citómetros del flujo. Generalmente no se pueden separar las poblaciones de NRBC de las poblaciones de linfocitos cuando las señales detectadas se ven en los diagramas de puntos de dispersión de luz bidimensional (frontal frente a lateral) o de dispersión de luz frente a absorción generalmente aceptados. Las señales de la mayoría de la población de NRBC están mezcladas habitualmente con las señales del estroma de RBC y de plaquetas ("PLT") y el extremo superior del grupo de NRBC con mucha frecuencia se extenderá al espacio ocupado por la población de linfocitos.

Los instrumentos de hematología clínica automatizados, tales como los instrumentos Technicon H*1®, Coulter STK® S y Abbott Cell-Dyn® 3000 y 3500 solo "señalan" muestras para la posible presencia de NRBC si el diagrama de puntos de la muestra presenta señales de ruido aumentadas por debajo del grupo de linfocitos. Este tipo de señalización produce muy a menudo resultados de falso positivo puesto que el nivel de ruido elevado podría deberse a grupos de PLT, PLT gigantes o RBC lisados incompletamente. Además, es extremadamente difícil obtener un recuento Total de WBC y Diferencial de WBC ("WBC/Diff") precisos en muestras que contienen NRBC debido a la interferencia. Adicionalmente, los frotis sanguíneos de las muestras señaladas deben examinarse y contarse en el microscopio por un técnico experto en la materia para obtener recuentos de NRBC y diferenciales de WBC precisos. Esto es un trabajo muy intensivo y un proceso subjetivo.

A pesar de estas dificultades, la identificación y cuantificación de células dañadas entre células intactas en una muestra puede ser de importancia para la caracterización precisa de poblaciones celulares que exhiben muerte celular espontánea o células afectadas por agentes citotóxicos o fármacos contra el cáncer. Las células no viables pueden unirse a anticuerpos u otros marcadores celulares de manera inespecífica, y por lo tanto deberían identificarse y cuantificarse en el inmunofenotipado así como a partir de los análisis hematológicos.

In vivo, hay dos formas diferentes de muerte celular: apoptosis y necrosis. La apoptosis, el término introducido por Kerr et al., es una muerte celular programada genéticamente que se produce durante la metamorfosis, embriogénesis y morfogénesis. Los neutrófilos experimentan apoptosis durante la reacción inflamatoria, los linfocitos en la regulación del sistema inmune. El daño celular debido a una variedad de agentes incluyendo daños citotóxicos quimioterapéuticos puede conducir a apoptosis. También se ha demostrado la apoptosis en tejidos premalignos y malignos. Durante el proceso de apoptosis, la membrana celular permanece intacta y la célula se rompe en cuerpos apoptóticos que después se fagocitan. La necrosis o muerte celular accidental, por otro lado, se produce en respuesta a daños nocivos tales como daño físico, hipoxia, hipertermia, inanición, ataque del complemento y daño químico. Estas células pierden la capacidad para filtrar selectivamente materiales extracelulares y experimentan fugas, finalmente perdiendo su membrana plasmática. Las células que han perdido la integridad de la membrana plasmática, se vuelven permeables a compuestos externos tales como tintes que normalmente no penetrarían en la membrana celular intacta, se considera que son "no viables" o dañadas. Las células dañadas que han perdido su integridad de membrana plasmática tampoco funcionan metabólicamente.

In vitro, un fenómeno similar, la muerte celular, se produce a medida que las muestras sanguíneas envejecen o durante los procedimientos de preparación de células que dañan la célula antes del análisis citométrico de flujo. Los procedimientos de preparación de células actuales someten a las células a un proceso largo que incluye el marcaje de células con anticuerpos monoclonales (Mab), el lisado de glóbulos rojos (RBC) y la fijación de los glóbulos blancos (WBC) para prevenir una destrucción adicional.

La combinación de 90º y las técnicas de dispersión de luz frontal se ha usado en la técnica para distinguir células dañadas de células intactas. Se ha descubierto, sin embargo, que la dispersión de luz sola no es lo suficientemente sensible para separar claramente y cuantificar las células dañadas o no viables de las células viables o intactas. Esto es particularmente cierto si una muestra contiene poblaciones celulares heterogéneas tal como una muestra sanguínea. El uso de un tinte fluorescente de ácidos nucleicos además de la dispersión de luz multiángulo aumenta dramáticamente la sensibilidad de la detección de células muertas. Actualmente existen una variedad de técnicas que utilizan métodos de fluorescencia y dispersión de luz para determinar si una célula en una muestra está intacta o dañada. De acuerdo con la técnica disponible, las células intactas se pueden distinguir de las células muertas usando bien diacetato de fluoresceína (FDA) o yoduro de propidio (PI). En estos métodos, la muestra se trata con FDA o PI. Las células que se tiñen con FDA se consideran viables y las células que se tiñen con PI se consideran "muertas". Sin embargo, estos métodos están limitados ya que las células no se pueden fijar puesto que las células fijadas generan autofluorescencia. Además, la fluoresceína, que es un producto del FDA después de la hidrólisis por una esterasa intracelular, es tan brillante que sobrepasa las señales de inmunofluorescencia de otros tintes tales como el FITC o la ficoeritrina (PE).

Las Patentes de Estados Unidos Nº 4.661.913 y 4.284.412 describen métodos de diferenciación de subpoblaciones de WBC mediante análisis de dispersión de luz en un citómetro de flujo. La Patente de Estados Unidos Nº 4.520.110 describe un método de diferenciación de poblaciones heterogéneas de leucocitos mediante inmunofenotipado usando una combinación de dispersión de luz y fluorescencia. Cada uno de los métodos descritos anteriormente requiere la preparación de manual muestras y un tiempo de incubación mucho más largo para incorporarse en un analizador de hematología multiparámetro rápido actual. Adicionalmente, estas referencias no parece que enseñen como distinguir células dañadas...

1. Un método de diferenciación de glóbulos rojos nucleados NRBC, glóbulos blancos dañados y glóbulos blancos WBC en una muestra por citometría de flujo que comprende:

2. El método de la reivindicación 1 donde el primer intervalo de ángulos de dispersión es de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º.

3. El método de la reivindicación 1 donde el parámetro de luz dispersada en un primer intervalo de ángulos de dispersión es la pérdida de luz del eje ALL.

4. El método de la reivindicación 4 en el que la ALL se obtiene a un ángulo de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º.

5. El método de la reivindicación 1 donde un parámetro de señal obtenido comprende pérdida de luz del eje ALL.

6. El método de la reivindicación 1 donde un parámetro de dispersión obtenido es dispersión de ángulo frontal FSC.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho primer intervalo de ángulos de dispersión comprende ángulos de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º y dicho segundo intervalo de ángulos comprende ángulos de aproximadamente 3º - 10º.

8. El método de la reivindicación 1 donde el tinte nuclear se selecciona del grupo que consiste en yoduro de propidio PI, bromuro de etidio EBr, homodímero de etidio-1 EthD-1, homodímero de etidio-2 EthD-2 y dietilentriamina DTA.

9. El método de la reivindicación 1 donde el recuento determinado de NRBC se sustrae de los recuentos determinados de WBC antes de la determinación de WBC/Diff.

10. El método de la reivindicación 1 que además comprende la etapa de adición de anticuerpos marcados con fluorescencia a la muestra y la incubación de la mezcla anticuerpo/muestra durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos se unan con su pareja de unión, los antígenos de superficie, antes de la etapa (a).