Método de agrupamiento de muestras para realizar un análisis biológico.

Método de agrupamiento de muestras que deben ser analizadas en cuanto a una variable categórica,

donde el análisis implica una medición cuantitativa de un analito, dicho método de agrupamiento de muestras comprende proporcionar un agrupamiento de n muestras donde la cantidad de muestras individuales en el agrupamiento es de manera que los analitos en las muestras están presentes en una proporción molar de x°: x1: x2: x(n-1), y donde x es un número entero de 2 o más alto representando el número de clases de la variable categórica

Método de agrupamiento de muestras para realizar un análisis biológico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de mediciones con resultados categóricos en muestras biológicas, más en particular a métodos para la preparación de la muestra de ensayos biológicos con resultados categóricos. La presente invención proporciona un método de agrupar muestras, el uso de dicho método para genotipificación de una variante alélica. La invención además proporciona un método de realizar un análisis en muestras múltiples, un dispositivo de agrupamiento para agrupar muestras múltiples en una muestra agrupada, un dispositivo de análisis que comprende un procesador que está dispuesto para realizar un análisis en un conjunto de muestra agrupada, un producto de programa informático en un portador que aplica un método de agrupamiento de muestras, y un producto de programa informático en un portador que aplica un método para realizar un análisis en muestras múltiples.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un bioensayo es un procedimiento donde una propiedad, concentración o presencia de un analito biológico se mide en una muestra. Los ensayos biológicos son una parte intrínseca de investigación en todos campos de ciencia, más especialmente en ciencias vitales y especialmente en la biología molecular.

Un tipo particular de análisis en biología molecular se refiere a genotipificación y secuenciación. Genotipificación y secuenciación se refieren al proceso de determinar el genotipo de un individuo con un ensayo biológico. Métodos actuales incluyen PCR, secuenciación de ADN y ARN, e hibridación para micromatrices de ADN y ARN montadas sobre diferentes portadores tales como placas de vidrio o esferas. La tecnología es intrínseca para pruebas en paternidad/maternidad, en la investigación clínica para la investigación de genes asociados a la enfermedad y en otra investigación dirigida a investigar el control genético de propiedades de cualquier especie por ejemplo escaneo completo del genoma para QTL (Loci de carácter cuantitativo) .

Debido a limitaciones tecnológicas actuales, casi toda la genotipificación es parcial. Es decir, solo una fracción pequeña de un genotipo del individual es determinada. En muchos casos esto es no un problema. Por ejemplo, en la prueba de paternidad/maternidad, solo se investigan 10 a 20 regiones genómicas para determinar la relación o la falta de esta, que es una fracción ínfima de la genoma humano.

Los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) son el tipo más abundante de polimorfismo en el genoma. Con los desarrollos paralelos de densos mapas marcadores SNP y tecnologías para genotipificación SNP de alto rendimiento (p. ej. Kirov G. et al, BMC Genomics (2006) , 15 (7) :1471-2164 and Hoh J et al, BMC Bioinformatics (2003) , 22 (4) : 1471 - 2105) , SNP han llegado a ser los marcadores de elección para muchos estudios genéticos. Un número sustancial de muestras se requiere en el mapeo y estudios de asociación o en los experimentos de selección genómica.

Para proveer para capacidades de genotipificación de alto rendimiento, tecnologías de matriz han sido desarrolladas (p. ej. US 2002/172965 A1) . Tales tecnologías están disponibles de proveedores comerciales tal como Affymetrix (microarray-based GeneChip® Mapping arrays) , Illumina (BeadArray™) , Biotrove (Open Array™) and Sequenom (MassARRAY™) . En muchas especies (seres humanos, ganado, plantas, bacterias y virus) un gran número de SNP están disponibles o se harán disponibles pronto. Las nuevas innovaciones han permitido la genotipificación del genoma entero o estudios de asociación y programas de selección de genoma entero asociado para cría de plantas y animales. Aún los costes de tales programas son todavía significativos, requieren presupuestos de hasta varios millones de dólares si las muestras son genotipificadas individualmente. Por lo tanto, los estudios dirigidos a la identificación de SNP en cualquier especie, actualmente implican análisis de solo un número limitado de individuos. La presente invención por lo tanto es de gran importancia ya que permite una reducción muy sustancial del coste de genotipificación.

Para obtener comprensión completa en la variabilidad genómica es preciso conocer la secuencia completa de (una parte pertinente de) el genoma. No obstante, el coste de determinar la secuencia completa es incluso superior al coste de genotipificación que se ha descrito en el párrafo precedente. A pesar de los costes, se espera que la secuenciación reemplace a la genotipificación para proporcionar genotipos individuales para todo el genoma o regiones específicas de este. La presente invención también proporciona métodos para reducir el coste de secuenciación.

El agrupamiento de muestras es regularmente usada en estudios en rasgos categóricos como medio para reducir costes de análisis. La presencia de la característica en el agrupamiento, que consiste en una mezcla de diferentes muestras indica la presencia de esta característica en al menos una de las muestras en ese grupo. Depósitos de ADN se usan por ejemplo para:

-estimar frecuencias alélicas en una población.

Tomando una buena muestra de individuos de la población, la frecuencia alélica pura del alelo 1 se calcula como la proporción entre el resultado para el alelo 1 y la suma del resultado para el alelo 1 y el resultado para el alelo 2 en el agrupamiento.

- estudios de asociación caso-control donde casos y controles se dividen en grupos separados, y

- reconstruir haplotipos en un número limitado de individuos y un número limitado de SNP.

En base a las frecuencias alélicas medidas en el agrupamiento, los haplotipos se pueden estimar por diferentes algoritmos tal como probabilidad máxima. El término frecuencia de haplotipo es sinónimo del término distribución conjunta de marcadores.

Una desventaja importante del agrupamiento de muestras es que la característica medida solo se identifica en el agrupamiento como conjunto, y no en cualquiera de las muestras individuales en el agrupamiento (p. ej. WO 2005/075678 A ; US2003/152942 A1 ; Lindroos K et al, NAR (2002) , 30 (14) :1-9 and Wolford JK et al, Hum Genet (2000) , 107 (5) :483-7) . Una excepción es agrupamientos de ADN para tríos de genotipificación (padre, madre y niño) cuando dos agrupamientos en que cada uno consiste en dos individuos son creados (padre + niño y madre + niño) . La frecuencia alélica observada en cada grupo es indicativa de los genotipos para los 3 individuos. Este tipo de agrupamiento de muestras proporciona una reducción de coste de 33 % pero sólo es posible con tales tríos. En todos los otros casos, las muestras agrupadas deben ser reanalizadas individualmente para proporcionar resultados para las muestras individuales.

Así, sería beneficioso proporcionar agrupamientos de muestras para tipos de muestra diferentes de los tríos, a la vez que todavía se provean resultados de la prueba para las muestras individuales dentro de ese agrupamiento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han descubierto ahora que individuos aleatorios se pueden agrupar y que genotipos individuales se pueden recuperar de tales agrupamientos cuando la aportación de cada muestra individual en el agrupamiento es una proporción fija de la cada otra muestra, es decir cuando las cantidades de muestra no son equimolares pero proporcionadas en proporciones específicas. Los resultados para muestras individuales se pueden inferir del resultado de prueba agrupado a condición de que la prueba implique una medida cuantitativa de una variable categórica, es decir que la prueba implique una característica discreta o categórica que es medida de forma cuantitativa.

De hecho, los presentes inventores han encontrado que para el estudio de la presencia de un alelo determinado en un locus determinado en un animal diploide, la mezcla en una proporción de 1:3 de una muestra de ADN de un primer animal diploide con 2 alelos posibles (A o B) en un único locus, con una muestra de ADN de un segundo animal diploide que también tiene 2 alelos posibles (A o B) en el mismo locus, produce la presencia de (2) + (2+2+2) = 8 posibilidades para cualquiera de los alelos en que mezcla, donde la señal del instrumento cuantitativo prevista a partir de un único alelo (p. ej. A) es 12, 5 % de la fuerza máxima de señal de muestra. Esto significa que a una intensidad de señal medida de 37.5 % de la máxima fuerza de señal de muestra, la muestra comprende 3 x el alelo A, lo que significa que la señal no se puede derivar del primer animal diploide y pueden solo derivar del segundo animal diploide, indicando que el primer animal diploide... [Seguir leyendo]

1. Método de agrupamiento de muestras que deben ser analizadas en cuanto a una variable categórica, donde el análisis implica una medición cuantitativa de un analito, dicho método de agrupamiento de muestras comprende proporcionar un agrupamiento de n muestras donde la cantidad de muestras individuales en el agrupamiento es de manera que los analitos

en las muestras están presentes en una proporción molar de x°: x1: x: x (n-1) , y donde x es un número entero de 2 o más alto representando el número de clases de la variable categórica.

2. Método según la reivindicación 1, donde el analito es una biomolécula y la variable categórica es una variante de dicha biomolécula.

3. Método según la reivindicación 2, donde la biomolécula es un ácido nucleico.

4. Método según la reivindicación 3, donde la variante es un polimorfismo de nucleótido en dicho ácido nucleico.

5. Método según la reivindicación 4, donde el polimorfismo de nucleótido es un SNP.

6. Método según la reivindicación 3, donde la variante es la identidad de base de una posición particular de nucleótidos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la medición cuantitativa comprende la medición de la intensidad, altura de pico o superficie de pico de una señal de instrumento.

8. Método según la reivindicación 7, donde la señal de instrumento es una señal de fluorescencia.

9. Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para genotipificación de una variante alélica en individuos poliploides o haploides donde el número de clases del variable categórica (x) es igual a p+1, donde p representa el nivel de ploidía.

10. Uso según la reivindicación 9, donde x es 3, para genotipificación de una variante alélica en individuos diploides.

11. Método de realizar un análisis en muestras múltiples, que comprende el agrupamiento de dichas muestras según un método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para proporcionar una muestra agrupada y la realización de dicho análisis en dicha muestra agrupada.

12. Método de realizar un análisis en muestras múltiples según la reivindicación 11, donde dicha muestra se analiza en cuanto a una variable categórica e implica una medición cuantitativa de un analito en dicha muestra.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende además deducir de la medición la aportación de las muestras individuales en dicho agrupamiento de muestras.

14. Dispositivo de agrupamiento para agrupamiento de muestras múltiples en una muestra agrupada que comprende un colector de muestra para suministrar una muestra agrupada y además comprende un procesador que está dispuesto para recibir instrucciones de un programa de ordenador que aplica en el dispositivo de agrupamiento un método de agrupamiento de muestras según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

15. Dispositivo según la reivindicación 14, que incluye además un dispositivo de análisis que comprende un procesador que está dispuesto para realizar un análisis en la muestra agrupada proporcionado por el dispositivo de agrupamiento, donde dicho dispositivo de análisis está dispuesto para analizar dicha muestra en cuanto a una variable categórica y para realizar una medición cuantitativa de un analito en dicha muestra.

16. Producto de programa informático en un portador, el cual producto de programa, cuando se carga y ejecuta en un ordenador, una red informática programada u otro equipo programable, aplica un método de agrupamiento de muestras según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

17. Producto de programa informático según la reivindicación 16, donde el método comprende además el paso de realizar un análisis en muestras múltiples, dicho método comprende la realización de un análisis en la muestra agrupada, donde dicha muestra se analiza en cuanto a una variable categórica e implica una medición cuantitativa de un analito en dicha muestra.