Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células.

Un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprende al menos una poliamina y al menosun hidrolizado de proteínas derivado del grupo formado por vegetales y levaduras,

en el que la poliamina está presenteen el medio de cultivo en una concentración que varía entre 0,5 y 10 mg/L y el hidrolizado de proteínas está presente enuna concentración que varía desde el 0,05 % (p/v) hasta el 1 % (p/v).

Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprende una poliamina y un hidrolizado derivado de vegetales y/o de levaduras. La invención también se refiere a procesos de cultivo exentos de proteínas animales, en los que las células pueden ser cultivadas, propagadas y pasadas sin añadirproteínas animales complementarias al medio de cultivo. Estos procesos son útiles para cultivar células, tales comocélulas recombinantes o células infectadas con un virus, y para producir productos biológicos mediante procesos decultivo celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para el cultivo de células, particularmente de células eucariotas, y más específicamente células de mamífero, existe una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que hacen disponibles las sustancias nutrientes decrecimiento que son necesarias para un crecimiento eficaz de las células y para la producción de las proteínas o de los virus que se desean. Para la producción eficaz de productos biológicos, tales como virus o proteínas recombinantes, es importante que se alcance una densidad celular óptima, así como que se aumente la propia expresión de proteínas paraobtener un rendimiento máximo del producto.

Las formulaciones de medios de cultivos celulares se han complementado con diversos aditivos, que incluyencomponentes no definidos tales como suero bovino fetal (fetal calf serum, FCS) , diversas proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino.

En general, el suero o las sustancias derivadas del suero, tales como la albúmina, la transferrina o la insulina, pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productos biológicos obtenidos a partir de los mismos. Adicionalmente, los aditivos derivados de suero humano deben ser ensayados paracomprobar todos los virus conocidos, incluyendo hepatitis y VIH, que pueden ser transmitidos por el suero. Además, el suero bovino y los productos derivados del mismo son portadores de un riesgo de contaminación por BSE. Además, todo los productos derivados de suero pueden estar contaminados por constituyentes desconocidos. En el caso delsuero o de aditivos proteicos que derivan de seres humanos o de otras fuentes animales en cultivos celulares, existennumerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable de la composición de los diferentes lotes y el riesgo decontaminación por micoplasma, virus o BSE) , particularmente si las células se usan para la producción de fármacos o de vacunas para su administración a seres humanos.

Por lo tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas hospedadores y condiciones de cultivo eficaces que no requieran suero ni otros compuestos proteicos animales. El medio simple exento de suero incluye típicamente medio basal, vitaminas, aminoácidos o sales orgánicas o inorgánicas, y opcionalmente componentes adicionales para hacer el medio nutricionalmente complejo.

Se sabe que los hidrolizados de soja son útiles para los procesos de fermentación y pueden mejorar elcrecimiento de muchos organismos de cultivo difícil, levaduras y hongos. El documento WO 96/26266 describe que losdigeridos papaicos de harina de soja son una fuente de carbohidratos y de nitrógeno y muchos de los componentes pueden usarse en un cultivo tisular. Franek y col. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688 – 692) describen los efectospromotores del crecimiento y de la productividad de fracciones peptídicas definidas del hidrolizado de soja.

El documento WO 96/15231 desvela un medio exento de suero formado por medio sintético mínimo esencial y extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y procesos de producción de virus. En el documentoWO 98/15614 se desvela una formulación de medio compuesta por medio de un cultivo de células basal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura, y la digestión enzimática de los mismos, y/o un lípido vegetal para el crecimiento de células animales. El documento WO 01/23527 desvela un medio que comprende un hidrolizado de sojapurificado para el cultivo de células recombinantes. El documento WO 00/03000 desvela un medio que comprende unhidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínasanimales, tales como factores de crecimiento.

El documento WO2004/005493 describe un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprende una combinación de péptidos no derivados de animales procedentes de hidrolizado de soja y de hidrolizado de levadura. El documento WO01/11021 se refiere a un clon celular recombinante estable que es estable en un medioque no contiene suero ni proteínas durante al menos 40 generaciones. El documento FR72.29396 describe un medio decultivo para la selección de bacterias en el que el medio está exento de proteínas animales. El documento WO02/24876 se refiere a un proceso para aislar virus procedentes de varias fuentes y para producir vacunas antigripales de virus vivos atenuados en un cultivo de células Vero exento de suero en unas condiciones en las que se minimizan o se evitan alteraciones en los antígenos de superficie del virus debido a la selección adaptativa.

El documento EP-A-0 481 791 describe un medio de cultivo bioquímicamente definido para cultivar célulasCHO modificadas genéticamente que está exento de proteínas, lípidos y carbohidratos aislados a partir de una fuenteanimal, que comprende además una insulina recombinante o un análogo de insulina, del 1 % al 0, 025 % p/v de digeridode papaína de peptona de soja y putrescina. El documento WO 98/08934 describe un cultivo celular eucariota exento desuero que comprende péptidos de hidrolizado de soja (1 – 1000 mg/L) , de 0, 01 a 1 mg/L de putrescina y varios componentes derivados de animales, incluyendo albúmina, fetuína, varias hormonas y otras proteínas. En este contexto, también debería mencionarse que también se sabe que la putrescina está contenida en medios estándar tales comoDMEM/Ham's F12 a una concentración de 0, 08 mg/L.

Sin embargo, los medios conocidos en el estado de la técnica son a menudo nutricionalmente insuficientes y/o deben ser complementados con complementos proteicos derivados de animales o versiones recombinantes de proteínas, tales como insulina, factor de crecimiento insulinoide u otros factores de crecimiento.

Por lo tanto, existe una necesidad actual de aumentar el rendimiento de la proteína recombinante expresada o de cualquier otro producto de expresión, y de la tasa de crecimiento específica de las células, y de proporcionar unmedio de cultivo celular óptimo completamente exento de proteínas animales para la producción de productosbiológicos, tales como los usados como productos farmacéuticos o como vacunas en seres humanos.

Sobre la base de extractos de peptona de soja (también denominados "hidrolizados de soja") se han desarrollado medios que no contienen proteínas animales. Sin embargo, la calidad de los lotes disponiblescomercialmente de hidrolizados de soja varía extremadamente y, como resultado, existen amplias variaciones en laproducción de proteínas recombinantes o de productos víricos (una variación de hasta en un factor de 3) en función de los lotes de hidrolizado de soja usados ("variación interlote") . Este inconveniente afecta a la proliferación de las células, así como a la expresión proteica de cada célula.

Por lo tanto, hay una necesidad de un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que estécompletamente exento de proteínas animales y supere al menos uno de los problemas mencionados anteriormente.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención es proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que no contenga ninguna proteína complementaria añadida derivada de una fuente animal ni/o proteínas animales recombinantes, que permita un crecimiento celular eficaz y en particular la producción proteica, con una calidad continuacon respecto a la cantidad de expresión por célula. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para cultivar células y un procedimiento para la expresión eficaz de proteínas recombinantes que estánexentas de proteínas animales.

Otro objeto de la presente invención es reducir el hidrolizado derivado de vegetales y/o de levaduras con objetode superar los efectos inhibidores que impactarían negativamente sobre el rendimiento de la producción de un productorecombinante o vírico deseado. Sorprendentemente se encontró que los hidrolizados eran la... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprende al menos una poliamina y al menos un hidrolizado de proteínas derivado del grupo formado por vegetales y levaduras, en el que la poliamina está presenteen el medio de cultivo en una concentración que varía entre 0, 5 y 10 mg/L y el hidrolizado de proteínas está presente enuna concentración que varía desde el 0, 05 % (p/v) hasta el 1 % (p/v) .

2. El medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, en el que la poliamina seelige del grupo formado por cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, ornitina y una combinación delas mismas.

3. El medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en elque el medio de cultivo contiene ornitina, putrescina y espermina.

4. El medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, en el que la poliamina seorigina a partir de una fuente distinta a un hidrolizado de proteínas.

5. El medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, en el que el hidrolizado deproteínas deriva de una planta elegida del grupo formado por cereales y soja.

6. Un procedimiento para cultivar células, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1, y

(b) propagar las células en el medio para formar un cultivo celular.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

8. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células se cultivan mediante un procedimiento elegidodel grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo semicontinuo, cultivo por perfusión y cultivo quimioestático.

9. Un procedimiento para expresar una proteína objetivo, que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de células en un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según lareivindicación 1; b) introducir en las células una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica la

proteína objetivo; c) seleccionar las células portadoras de la secuencia de ácidos nucleicos; e d) inducir selectivamente la expresión de la proteína objetivo en las células.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

11. El procedimiento según la reivindicación 9 en el que la combinación de célula / proteína objetivo se elige delgrupo formado por células CHO / factor de coagulación VIII, células BHK / eritropoyetina, virus de Epstein Barr transformado, linfocitos B humanos inmortalizados / anticuerpos humanos.

12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las células se cultivan mediante un procedimiento elegidodel grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo semicontinuo, cultivo por perfusión y cultivo quimioestático.

13. Un procedimiento para producir un virus, que comprende las etapas de:

a) hacer crecer un cultivo de células en un medio de cultivo celular exento de proteínas animales según la reivindicación 1; b) infectar las células con el virus; c) seleccionar las células infectadas por el virus; e d) incubar las células para propagar el virus.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células se eligen del grupo formado por células demamífero, células de insecto, células de ave, células bacterianas y células de levadura.

15. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que la combinación de célula / virus se elige del grupo formado por célula Vero / vacuna atenuada, célula Vero / vacuna, célula Vero / Hepatitis A, célula Vero / virus de lagripe, célula Vero / virus del Nilo occidental, célula Vero / virus del SARS y células embrionarias de pollo / virus de laFSME.

16. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células se cultivan mediante un procedimientoelegido del grupo formado por cultivo discontinuo, cultivo semicontinuo, cultivo por perfusión y cultivo quimioestático.