Medio de cultivo de microorganismos que comprende el ácido para-aminobenzoico como agente selectivo.

Medio de cultivo para la detección de al menos un microorganismo diana que comprende:

* al menos un sustrato, natural o sintético, de fermentación o de actividad enzimática, y

* al menos un agente selectivo, que permite la inhibición de los microorganismos no-diana, constituido por el ácido para-aminobenzoico, uno de sus derivados o una de sus sales, a una concentración comprendida entre 0,05 y 1 g/l, preferiblemente entre 0,05 y 0,8 g/l.

Medio de cultivo de microorganismos que comprende el ácido para-aminobenzoico como agente selectivo

El campo de la invención es el del análisis de microorganismos diana en una muestra compleja.

Más particularmente, la presente invención se refiere a la detección de microorganismos tales como las bacterias del género Salmonella, mediante un medio de cultivo que contiene el ácido para-aminobenzoico como agente selectivo.

La calidad y la seguridad de los productos disponibles en el mercado forman parte de las preocupaciones principales de la industria agroalimentaria a nivel mundial. En las materias primas y en los productos finales, debe ser posible detectar, identificar y cuantificar la flora microbiana, y garantizar así el valor de los productos, desde su fabricación hasta su consumo. Es importante distinguir, por un lado, los indicadores de calidad del producto, reflejo de un porcentaje de contaminación global por una flora de alteración a la que pertenecen las enterobacterias como Escherichia coli, los estafilococos coagulasa positivos, los Pseudomonas, los Bacillus, las levaduras, los mohos, etc. y, por otro lado la detección de los patógenos tales como las bacterias del género Salmonella o Listeria monocytogenes. Para ello, el análisis microbiológico es primordial en términos de salud pública y en términos económicos para esta industria.

El desarrollo de ensayos de detección de microorganismos diana en una muestra responde a fuertes restricciones y es necesario encontrar un compromiso entre la sensibilidad, definida como la capacidad de poner en evidencia la especie buscada, cuando esta está presente en baja cantidad en una muestra a ensayar, y la selectividad, definida como la capacidad para detectar la especie buscada en la muestra que contiene también otras especies. La combinación de los componentes que aseguran la sensibilidad, con los que aseguran la selectividad, permite obtener un ensayo específico.

El criterio de sensibilidad impone frecuentemente recurrir a una composición que permite cultivar los microorganismos diana, a fin de hacerlos detectables. La especificidad puede así ser aportada por la incorporación en el medio de cultivo de una molécula marcadora implicada en el metabolismo de los microorganismos diana; produciendo esta interacción una señal medible.

Por otro lado, dependiendo de si se desea detectar y enumerar un género específico o la totalidad de los gérmenes viables, se podrá utilizar o no un medio selectivo.

En el caso de la búsqueda de microorganismos dianas, en particular de bacterias, la utilización de medios de cultivos cromogénicos es cada vez más importante. La ventaja de tales medios es contener unos sustratos enzimáticos específicamente escindidos o digeridos por las bacterias diana, de manera que se genera un producto de reacción coloreado, permaneciendo generalmente localizado en las colonias de dichas bacterias. Esto permite diferenciar dichas bacterias diana de otros géneros bacterianos eventualmente presentes en la muestra, en particular en el caso de muestra agroalimentaria. Tales medios de cultivo permiten también la identificación de una especie bacteriana contenida en una muestra clínica, siendo esta especie generalmente el origen de una infección.

En el caso de la búsqueda de microorganismos diana patógenos en muestras agroalimentarias, parece generalmente que el microorganismo diana está presente en la población mixta de microorganismos y en cantidad más baja que los microorganismos no-diana. Además de la simple diferenciación del microorganismo diana con respecto a los microorganismos no-diana, existe también la necesidad de inhibir selectivamente el crecimiento de dichos microorganismos no-diana, a fin de poder detectar el microorganismo diana, sin lo cual el desarrollo de dichos microorganismos no-diana tendería a ocultar el microorganismo diana, a pesar de que las colonias de este último se encuentran coloreadas, y así conducir a resultados falsamente negativos.

En particular, es pertinente poder diferenciar las bacterias del género Salmonella de otros tipos bacterianos y en particular de bacterias gram negativas, tales como las bacterias de la especie Escherichia coli (£. coli) que están entre las bacterias comensales presentes en las muestras.

Para ello, el documento WO-A-96/3543 describe un medio de cultivo para la detección de Salmonella que comprende un sustrato cromogénico para las especies de enterobacterias (3-galactosidasa positivas tales como £. coli, y una mezcla de azúcares metabolizados por las Salmonella que generan un compuesto ácido y un indicador de pH que pone en evidencia la acidificación del medio. Por otra parte, unas sales biliares están presentes en el medio para inhibir selectivamente las especies gram positivas.

En los documentos EP-B-1 334 175 y EP-A-1 325 24 se ha descrito un método alternativo que permite detectar de manera específica las bacterias del género Salmonella y diferenciarlas de las bacterias gram negativas. Este método consiste en utilizar en un medio de cultivo, un agente selectivo que se presenta en forma de un sustrato denominado "suicida". Tal sustrato está constituido de una parte denominada "transportadora" y de una parte denominada "tóxica", estando estas partes unidas entre sí por un enlace destinado a ser cortado por las bacterias £. coli y no por

Salmonella, lo que conlleva la liberación y la concentración de la parte tóxica en el Interior de E. coli e Inhibiendo asi su crecimiento, en beneficio de la Salmonella. El sustrato suicida favorito es la alafosfallna.

Tal sustrato presenta como principal inconveniente que entra en competición con los aminoácidos presentes en el medio de cultivo. Asimismo, para que sea activo en un gran número de especies bacterianas, es necesario disponer de un medio de cultivo relativamente pobre en aminoácidos, lo que no favorece el crecimiento de las bacterias del género Salmonella. Además, la alafosfalina es un compuesto relativamente caro, lo que incrementa de manera importante el precio del medio.

La presente invención permite paliar estos inconvenientes proponiendo una solución que consiste en un medio de cultivo que comprende, a título de agente selectivo, el ácido para-aminobenzoico. Un medio de cultivo está aquí definido como un medio que comprende todos los elementos necesarios para la supervivencia y/o el crecimiento de microorganismos, a saber aminoácidos o hidrolizados de proteínas, de minerales, de vitaminas y de manera general, todos los nutrientes y todas las fuentes metabólicas conocidas por el experto en la materia para permitir el crecimiento microbiano.

En efecto, los inventores han demostrado, de manera muy sorprendente, que la adición de ácido para- aminobenzoico a concentración relativamente elevada, en un medio de cultivo adecuado, permite inhibir o ralentizar en particular el crecimiento de las bacterias gram negativas, tales como las enterobacterias, en beneficio de las bacterias del género Salmonella.

Más particularmente, la invención se refiere a un medio de cultivo para microorganismos que comprende:

* al menos un sustrato, natural o sintético, de fermentación o de actividad enzimática, y

* al menos un agente selectivo, constituido por el ácido para-aminobenzoico, uno de sus derivados o una de sus sales, a una concentración comprendida entre ,5 y 1 g/l, preferiblemente entre ,5 y ,8 g/l.

De manera preferida, el microorganismo diana es una bacteria del género Salmonella.

Los microorganismos no-diana se escogen del grupo de bacterias gram negativas que comprenden en particular las

enterobacterias.

Un derivado del ácido para-aminobenzoico puede ser seleccionado del grupo que comprende en particular el ácido 4-aminobenzoico, el ácido 4-(metilamino)benzoico, el ácido 4-amino-2-clorobenzoico, el ácido 4-amino-3- nitrobenzoico, el ácido 4-aminosalicílico.

Una sal aceptable puede ser, por ejemplo, una sal de potasio o una sal de sodio. Así, se puede utilizar como compuesto el 4-aminobenzoato de potasio o también el 4-am¡nobenzoato de sodio.

Ventajosamente, el medio de cultivo según la Invención comprende al menos un sustrato enzlmátlco cromogénico o fluorogénico.

Preferiblemente, el medio de cultivo según la Invención comprende además unas sales billares. Puede, por ejemplo, comprender desoxicolato de sodio.

De manera ventajosa, dicho medio de cultivo puede comprender al menos otro agente selectivo escogido del grupo que comprende: Novobiocina, Vancomicina, Amfoterlclna, Cefsulodlna.

En el sentido de la presente invención, el sustrato se selecciona entre todos los sustratos que pueden ser hidrolizados en un producto que permite la detección,... [Seguir leyendo]

1. Medio de cultivo para la detección de al menos un microorganismo diana que comprende:

* al menos un sustrato, natural o sintético, de fermentación o de actividad enzimática, y

* al menos un agente selectivo, que permite la inhibición de los microorganismos no-diana, constituido por el ácido para-aminobenzoico, uno de sus derivados o una de sus sales, a una concentración comprendida entre ,5 y 1 g/l, preferiblemente entre ,5 y ,8 g/l.

2. Medio de cultivo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo diana es una bacteria del género Salmonella.

3. Medio de cultivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que los microorganismos no-diana se escogen del grupo que comprende en particular las enterobacterias.

4. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado del ácido para-aminobenzoico se escoge del grupo que comprende: el ácido 4-aminobenzoico, el ácido 4-(metilamino)benzoico, el ácido 4-amino-2- clorobenzoico, el ácido 4-amino-3-nitrobenzoico, el ácido 4-aminosalicílico.

5. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un sustrato enzimático cromogénico o fluorogénico.

6. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende además unas sales biliares.

7. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende como sal biliar el desoxicolato de sodio.

8. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones anteriores, al menos otro agente selectivo escogido del grupo que comprende: Novobiocina, Vancomicina, anfotericina, Cefsulodina.

9. Procedimiento de detección de un microorganismo diana, en una población mixta de células diana y no-diana, que comprende las etapas que consisten en:

* poner en contacto una muestra en la que se desea poner en evidencia dichos microorganismos diana con un medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 8,

* incubar el conjunto a una temperatura que favorece la multiplicación de dichos microorganismos,

* observar los microorganismos sobre dicho medio de cultivo.

1. Utilización in vitro del ácido para-aminobenzoico, uno de sus derivados o una de sus sales, en un medio de cultivo como agente selectivo.

11. Utilización según la reivindicación anterior, en la que el ácido para-aminobenzoico, uno de sus derivados o una de sus sales, está presente en el medio de cultivo a una concentración comprendida entre ,5 y 1 g/l, preferiblemente entre ,5 y ,8 g/l.