Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en la enfermedad neurodegenerativa.

Utilización de una diaminofenotiazina en la preparación de una composición de medicamento para utilizar en eltratamiento o la profilaxis de una tauopatía,

en la que la preparación comprende la etapa de reducir previamente la diaminofenotiazina, de manera que estápresente en por lo menos el 80, 90, 95, ó 99% en la (leuco)forma reducida,

y en la que la diaminofenotiazina se reduce previamente mediante la adición de un agente reductor exógeno,y en la que la forma reducida está liofilizada,

y en la que la (leuco)diaminofenotiazina reducida previamente tiene la fórmula:

en la que R1, R3, R4, R6, R7 y R9 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, halógeno, hidroxilo,carboxilo, alquilo sustituido o no sustituido, haloalquilo o alcoxi;

R5 es hidrógeno; y

cada uno de R10 y R11 se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxilo, carboxilo, alquilo sustituido ono sustituido, haloalquilo o alcoxi;

o es una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en la enfermedad neurodegenerativa.

Campo técnico [0001] El presente documento describe a modelos basados en células y a otros sistemas de análisis para modelar la agregación de proteínas asociada con la enfermedad neurodegenerativa. La presente invención se refiere a compuestos capaces de modular dicha agregación.

Antecedentes de la técnica [0002] Los estados de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracterizan frecuentemente por una acumulación progresiva de depósitos intracelulares y/o extracelulares de estructuras proteicas tales como placas º-amiloides y marañas neurofibrilares en el cerebro de los pacientes afectados. El aspecto de estas lesiones se correlaciona en su mayor parte con una degeneración neurofibrilar patológica y una atrofia cerebral, así como con un deterioro cognitivo (Mukaetova-Ladinska, E. B. y col. (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, Nº 2, 623-636) .

Tanto las placas neuríticas como las marañas neurofibrilares contienen filamentos helicoidales apareados (PHF) , de los que un constituyente principal es la proteína tau asociada a microtúbulos (Wischik y col. (1988) PNAS EE.UU. 85, 4506) . Las placas también contienen fibrillas º-amiloides extracelulares derivadas de un procesado anormal de la proteína precursora amiloidea (APP; Kang y col. (1987) Nature 325, 733) . Un artículo de Wischik y col. (en ’Neurobiology of Alzheimer’s Disease’, 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford) , discute con detalle el papel putativo de la proteína tau en la patogenia de las demencias neurodegenerativas.

Los estudios de la enfermedad de Alzheimer indican que la pérdida de la forma normal de la tau (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) Am. J. Pathol., 143, 565; Wischik y col. (1995a) Neurobiol. Ageing, 16: 409; Lai y col. (1995b) Neurobiol. Ageing, 16: 433) , la acumulación de PHFs patológicos (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) , loc. cit.; Harrington y col. (1994a) Dementia, 5, 215; Harrington y col. (1994b) Am. J. Pathol., 145, 1472; Wischik y col., (1995a) , loc. cit.) y la pérdida de sinapsis en la corteza mesofrontal (Terr y y col. (1991) Ann. Neurol., 30, 572) se correlacionan con un deterioro cognitivo asociado. Adicionalmente, la pérdida de sinapsis (Terr y y col., loc. cit.) y la pérdida de células piramidales (Bondareff y col. (1993) Arch. Gen. Psychiatr y , 50: 350) se correlacionan ambas con medidas morfométricas de una patología neurofibrilar reactiva a tau, que es semejante, a un nivel molecular, a una redistribución prácticamente total del conjunto de proteínas tau desde una forma soluble a una polimerizada (PHFs) en la enfermedad de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) , loc. cit.; Lai y col. (1995) , loc. cit.) .

La tau existe en isoformas de corte y empalme alternativo, que contienen tres o cuatro copias de una secuencia repetitiva correspondiente al dominio de unión a microtúbulos (Goedert, M., y col. (1989) EMBO J. 8, 393399; Goedert, M., y col. (1989) Neuron 3, 519-526) . La tau de los PHF se procesa proteolíticamente a un dominio de núcleo (Wischik, C. M., y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 4884-4888; Wischik y col. PNAS EE.UU. 1988, 85: 4506-4510) ; Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12, 365-370) que está formado por la versión de fase alterna del dominio repetitivo; sólo hay tres repeticiones implicadas en la integración estable tau-tau (Jakes, R., y col. (1991) EMBO J. 10, 2725-2729) . Una vez formados, los agregados de tau de tipo PHF actúan como semillas para la captura adicional y proporcionan un plantilla para el procesado de la proteína tau completa (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218) .

En el transcurso de su formación y acumulación, los filamentos helicoidales apareados (PHFs) se agrupan en primer lugar para formar agregados amorfos dentro del citoplasma, probablemente a partir de oligómeros tempranos de tau que quedan truncados antes o en el transcurso de la agrupación de los PHF (Mena, R., y col. (1995) Acta Neuropathol. 89, 50-56; Mena, R., y col. (1996) Acta Neuropathol. 91, 633-641) . Estos filamentos continúan entonces para formar unas clásicas marañas neurofibrilares intracelulares. En este estado, los PHF están constituidos por un núcleo de tau truncada y una cubierta exterior y difusa que contiene la tau completa (Wischik., C. M., y col, (1996) loc. cit.) . El proceso de agrupación es exponencial, consumiendo el conjunto celular de tau funcional normal e induciendo una nueva síntesis de tau para compensar el déficit (Lai, R. Y. K., y col., (1995) , Neurobiology of Ageing, Vol. 16, Nº 3, 433-445) . Finalmente, el deterioro funcional de la neurona progresa hasta el punto de la muerte celular, dejando atrás una maraña extracelular. La muerte celular se correlaciona en gran medida con el número de marañas extracelulares (Wischik y col. 2000, loc. cit) . Dado que las marañas son empujadas hacia el espacio extracelular, hay una pérdida progresiva de la cubierta exterior difusa de la neurona-PHF con la correspondiente pérdida de la inmunorreactividad tau N-terminal, pero conservando la inmunorreactividad de la tau asociada con el núcleo de los PHF (Figura 1; también Bondareff, W. y col., (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., vol. 53, Nº 2, 158-164) .

El cambio de fase que se observa en el dominio repetitivo de la tau incorporada en los PHF sugiere que el dominio repetitivo experimenta un cambio conformacional inducido durante la incorporación en el filamento. Al inicio de la enfermedad de Alzheimer, se contempla que este cambio conformacional podría iniciarse por la unión de la tau a un sustrato patológico, tal como proteínas de membrana dañadas o mutadas (véase la Figura 2 - también Wischik, C. M., y col. (1997) en "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs. 185-241) .

En el caso de la enfermedad de Alzheimer, las terapias farmacéuticas actuales se centran en el tratamiento sintomático de la pérdida de la transmisión colinérgica resultante de la neurodegeneración (Mayeux, R., y col. (1999) New Eng. J. Med. 341, 1670-1679) . Sin embargo, aunque los tratamientos disponibles retrasan la progresión de la enfermedad en hasta 6 a 12 meses, no la previenen. El descubrimiento de fármacos que podrían impedir la agregación de la tau que da lugar a la neurodegeneración proporcionaría una estrategia más efectiva para la profilaxis o para la inhibición de la progresión de la enfermedad, que no requería un conocimiento inmediato de los diversos eventos que, cascada arriba, inician la agregación (véase la Figura 3) .

Modelos y ensayos [0009] El documento WO96/30766 describe un ensayo in vitro para la agregación de la tau en el que un fragmento de la tau correspondiente al dominio repetitivo del núcleo, que ha sido adsorbido sobre un sustrato en fase sólida, es capaz de capturar la tau soluble completa y unirse a la tau con una elevada afinidad (véase la Figura 4) . Esta asociación confiere estabilidad frente a la digestión de las proteasas de las moléculas de tau en los dominios repetitivos de las moléculas de tau que se han agregado. Este proceso es autopropagante y puede ser bloqueado selectivamente mediante agentes farmacéuticos prototipo ( (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218) .

Aunque el ensayo in vitro descrito en el documento WO96/30766 facilita la identificación de inhibidores o moduladores de la asociación tau-tau, los presentes inventores también han reconocido que podrían ser útiles los modelos basados en células de la agregación de proteínas del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Dichos modelos celulares podrían usarse tanto en el cribado primario de los candidatos moduladores de la agregación tau-tau, como en el cribado secundario de compuestos ya identificados en el ensayo in vitro del documento WO96/30766. Adicionalmente, la demostración de la agregación de la tau en células también podría ayudar en la identificación de los sustratos celulares normales que están implicados en el inicio de la agregación patológica de la tau, sustratos que por sí mismos podrían ser objetivos para una intervención farmacológica.

Sin embargo, numerosos artículos que describen la expresión de diversos construcciones de tau en modelos de cultivo tisulares no han conseguido demostrar la agregación (véase, por ejemplo, Baum, L. y col., (1995) Mol. Brain Res. 34:1-17) . Por ejemplo, los fibroblastos de ratón 3T3 no poseen proteína tau, y por lo tanto presentan un entorno celular en el que la tau recombinante... [Seguir leyendo]

1. Utilización de una diaminofenotiazina en la preparación de una composición de medicamento para utilizar en el tratamiento o la profilaxis de una tauopatía, en la que la preparación comprende la etapa de reducir previamente la diaminofenotiazina, de manera que está presente en por lo menos el 80, 90, 95, ó 99% en la (leuco) forma reducida, y en la que la diaminofenotiazina se reduce previamente mediante la adición de un agente reductor exógeno, y en la que la forma reducida está liofilizada, y en la que la (leuco) diaminofenotiazina reducida previamente tiene la fórmula:

en la que R1, R3, R4, R6, R7 y R9 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, halógeno, hidroxilo, carboxilo, alquilo sustituido o no sustituido, haloalquilo o alcoxi; R5 es hidrógeno; y cada uno de R10 y R11 se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxilo, carboxilo, alquilo sustituido o no sustituido, haloalquilo o alcoxi;

o es una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la forma reducida se estabiliza en el estado reducido mediante la adición de un agente estabilizador.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la forma reducida se liofiliza con el agente estabilizador.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición de medicamento comprende además uno o más de los siguientes: un excipiente, portador o tampón farmacéuticamente aceptable.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la composición de medicamento es una formulación de liberación lenta.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que R1, R3, R4, R6, R7 y R9 se seleccionan independientemente entre -hidrógeno, -CH3, -C2H5 o -C3H7; cada uno de R10 y R11 se selecciona independientemente entre hidrógeno, -CH3, -C2H5 o -C3H7; y R5 es hidrógeno, -CH3, -C2H5 o -C3H7.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la diaminofenotiazina tiene 0, 2, 3 ó 4 grupos metilo alrededor del núcleo de diaminofenotiazina.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la diaminofenotiazina está metilada asimétricamente.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la diaminofenotiazina es cloruro de tolonio, azura A, azura B o tionina.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la diaminofenotiazina se selecciona entre azul de metileno, azul O de toluidina, o azul de 1, 9-dimetilmetileno.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el tratamiento o la profilaxis comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de medicamento a un paciente con necesidad de la misma.

12. Utilización según la reivindicación 9, en la que el tratamiento o la profilaxis comprende administrar a un paciente una diaminofenotiazina que es tionina y ésta se administra al paciente en una dosis diaria de entre 1 y 1000 mg

opcionalmente dividida en 1 a 8 dosis unitarias.

13. Utilización según la reivindicación 10, en la que el tratamiento o la profilaxis comprende administrar a un paciente una diaminofenotiazina que es azul de metileno y la dosis diaria es de aproximadamente 3, 2-3, 5 mg/kg.