MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS PARA CAPTURAR LOS PATÓGENOS Y RETIRAR EL ÁCIDO AURINTRICARBOXÍLICO DE UNA MUESTRA.

Materiales y procedimientos para capturar los patógenos y retirar el ácido aurintricarboxílico de una muestra. Antecedentes de la invención El ácido aurintricarboxílico (ATA) es un anión polimérico que en la literatura ha demostrado ser un inhibidor potencial de la ribonucleasa. El compuesto se ha descrito como un aditivo a los reguladores de lisis de muestra en los que el objetivo es extraer especies de ARN a partir de tejidos de muestras. El extracto de ácido nucleico derivado de tales procedimientos ha demostrado ser adecuado para la hibridación y el análisis de electroforesis de gel. Sin embargo, ATA es un potente inhibidor de la transcriptasa inversa, que es esencial para la detección de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las especies de ARN. Los procedimientos publicados para retirar ATA de las composiciones que contienen ácido nucleico se han centrado en los procedimientos cromatográficos que eliminan o retiran solo una porción de ATA. La utilización de ATA en el regulador de lisis de la proteinasa K es superior potencialmente a 1) las sales caotrópicas (ya que éstas tienden a reducir la eficacia de la hidrólisis de proteína impulsada por la proteinasa K según evidencian los resultados de PCR); 2) los inhibidores de ribonucleasa basados en proteína (ya que estos inhibidores se escindirían por la proteinasa K); y 3) EDTA (que inhibe directamente solo las nucleasas vía quelación de los cationes divalentes utilizados por estas nucleasas). De hecho, los cationes divalentes se deben añadir a las preparaciones de ARN en las que se lleva a cabo la hidrólisis de ADN enzimática. Lo que no ha sido demostrado en la técnica anterior es un procedimiento en el que, una vez añadido, la extracción corriente abajo completa de ATA de los extractos de ácidos nucleicos puede ser alcanzada hasta el punto de que la transcriptasa inversa corriente abajo PCR (RT-PCR) funcionará. Sumario de la invención Según la presente invención, un procedimiento para la extracción de ácido nucleico a partir de una muestra que contiene ácido aurintricarboxílico (ATA), comprende poner en contacto la muestra con una composición que comprende urea y dietilentriaminpentaacetato (DTPA). Este procedimiento proporciona una composición de ácidos nucleicos suficientemente libre de ATA de manera que pueden realizarse una reacción RT-PRC y otras reacciones que implican la transcriptasa inversa. Breve descripción de los dibujos ES 2 365 976 T3 La figura 1 es una vista esquemática de un procedimiento dado a conocer. La figura 2 es una vista esquemática de la preparación del reactivo de lisis de la fibrina según el protocolo 1 descrito a continuación. La figura 3 es una tabla que proporciona datos sobre el protocolo de sangre del Bacillus anthracis. La figura 4 es una tabla que proporciona datos sobre una comparación de dos muestras de sangre de individuos diferentes. La figura 5 es una tabla que proporciona datos sobre una evaluación del laboratorio del Departamento de Salud. La figura 6 es una tabla que proporciona datos sobre el protocolo de sangre Yersinia pestis. La figura 7 es una vista esquemática del montaje de los reactivos de extracción según el protocolo 1 descrito a continuación. Las figuras 8-9 son vistas esquemáticas de la recuperación bacteriana y de la lisis de la fibrina según el protocolo 1 descrito a continuación. Las figuras 10-13 son vistas esquemáticas de la lisis bacteriana y de la extracción de ácido nucleico según el protocolo 1 descrito a continuación. La figura 14a es una vista esquemática de las etapas de reactivos de la extracción según el protocolo 2 descrito a continuación. La figura 14b es una vista esquemática de las etapas de reactivos de la extracción según el protocolo 2 descrito a continuación. La figura 15 es una vista esquemática de las etapas de reactivos de la extracción según el protocolo 3 descrito a continuación. 2 La figura 16a es una vista esquemática de las etapas de reactivos de la extracción según el protocolo 4 descrito a continuación. La figura 16b es una vista esquemática de las etapas de reactivos de la extracción según el protocolo 4 descrito a continuación. La figura 17 es una tabla que proporciona datos sobre la banda de ruido de los puntos en forma de cruz para las muestras de sangre sembradas con B. anthracis y tratadas con plasminógeno, estreptocinasa, fosfolipasa A2, ADNasa I y lipasa con centrifugación o filtración. La figura 18 representa la sedimentación y la solubilización de los agregados de tejido a partir de muestras de sangre de 6 ml expuestas a diversos tratamientos de detergentes y enzimas. La figura 19 representa las características de filtración de muestras de sangre de 6 ml expuestas a diversos tratamientos de detergentes y enzimas. Exposición detallada de la invención ES 2 365 976 T3 Se dan a conocer asimismo procedimientos de extracción de patógenos infecciosos de una muestra biológica, tal como un volumen de sangre, e incluye las etapas de creación de un agregado de fibrina que confina los patógenos y la introducción de un reactivo de lisis de fibrina para exponer los patógenos al análisis y a la ADNasa para facilitar la extracción de ADN. Los reactivos de lisis de fibrina están constituidos por ADNasa, plasminógeno y estreptocinasa congelados en una proporción igual hasta que se necesite el reactivo de lisis de fibrina en el que la estreptocinasa reacciona enzimáticamente con plasminógeno para formar plasmina tras la descongelación y la introducción en la muestra de fibrina. Preferentemente, el plasminógeno se suspende en una solución salina acuosa antes de congelarse incluyendo NaCl y Na3PO4. El reactivo de lisis de fibrina está compuesto preferentemente de ADNasa y fosfolipasa A2. La enzima ADNasa se utiliza para facilitar la disrupción química y física de los elementos sanguíneos granulados que resultan del protocolo descrito anteriormente. La fosfolipasa A2 se utiliza para ayudar a la digestión de ADN humano mediante la destrucción de las bicapas de fosfolípidos y, por lo tanto, de la destrucción de la membrana nuclear. La presente exposición utiliza la resuspensión de las enzimas secas en una solución de regulador utilizando fosfato de potasio como una ayuda para la solubilización de los elementos sanguíneos. La estreptocinasa y el plasminógeno no se deben mezclar con la solución de regulador hasta inmediatamente antes de la adición de la muestra de sangre. El intervalo de pH del fosfato de potasio es aproximadamente de 7,8 a 8,0, que es diferente de la técnica anterior que reivindica un intervalo de pH eficaz de 7,2 a 7,6. La técnica anterior utiliza soluciones de iones fosfato con un pH inferior para actuar como un regulador verdadero; sin embargo, el procedimiento actual permite la actividad de la fosfolipasa A2 óptima y la solubilidad del magnesio. El magnesio está presente en la solución de regulador como el catión divalente que impulsa la actividad de la fosfolipasa A2 en presencia de la ADNasa. La técnica anterior utiliza calcio como el catión divalente clásico para impulsar la actividad de la fosfolipasa A2, sin embargo, el calcio no es compatible con los iones fosfato esenciales para la solubilización de elementos de sangre. Una forma de realización de la presente exposición incluye concentrar y extraer partículas tales como priones, toxinas, marcadores metabólicos, materias cancerosas, marcadores de estado de enfermedad, bacterias, virus y hongos de un volumen de sangre mediante la introducción de una combinación enzima-detergente para exponer los patógenos en la muestra de sangre y analizar las partículas de la muestra de sangre entonces fácilmente identificables mediante la extracción. La enzima-detergente puede ser un reactivo de lisis de fibrina que comprende plasminógeno y estreptocinasa. El plasminógeno y la estreptocinasa se pueden congelar en una proporción igual hasta que se necesite el reactivo de lisis de fibrina. La estreptocinasa reacciona a continuación con el plasminógeno para formar plasmina tras el descongelado. El plasminógeno se puede suspender en una solución salina acuosa antes del congelado. Las soluciones salinas adecuadas pueden incluir NaCl, NaPO4 o similares. Para potenciar el análisis, las partículas se pueden replicar mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante la introducción de la ADNasa, se facilita el procedimiento mediante la conversión de ADN en fragmentos cortos que contribuyen así a un procedimiento de hidrólisis de proteína más rápida y más eficaz durante la extracción de ADN y la disminución de la carga del ADN humano inhibidor. De forma similar, la introducción de la endonucleasa produce una ventaja similar. Como una alternativa a la congelación, la enzima-detergente puede incluir estreptocinasa y plasminógeno secos como reactivos de lisis de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la extracción de ácido nucleico de una muestra que contiene ácido aurintricarboxílico (ATA), que comprende poner en contacto la muestra con una composición que comprende urea y dietilentriaminpentaacetato (DTPA). 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de urea en la muestra es de 6,0 a 7,5 M. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la composición comprende además citrato de sodio. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición comprende además hidróxido de sodio. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición comprende además 6-O-(N-heptilcarbamoíl)--D-glucopiranósido de metilo. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición comprende además proteinasa K. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición comprende además etilendiamintetraacetato. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH de la muestra se lleva a aproximadamente 8,0. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende además calentar la muestra. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende además una sal caotrópica. 11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra con una sal caotrópica. 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición es un polvo seco. 13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa previa de calentamiento de una solución de urea y DTPA a por lo menos 600ºC antes de que la composición sea combinada con una muestra. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la solución de urea y DTPA se calienta durante aproximadamente cuatro horas. 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extracción de ácido nucleico que comprende las etapas de lavado y/o de unión, y los reactivos utilizados para las etapas de lavado y unión son calentados hasta 55 a 65ºC antes o durante la puesta en contacto de la muestra con los reactivos utilizados para las etapas de lavado y unión. 16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además poner en contacto la muestra con la ureasa. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que se añaden 1.000 a 100.000 unidades de ureasa por ml de muestra. 18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es sangre. 19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra son bacterias unidas a partículas de fase sólida funcionalizadas con péptidos que se unen a las bacterias, en el que las bacterias se unen a dichas partículas en una composición que comprende además ácido aurintricarboxílico. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que los péptidos que se unen a las bacterias son seleccionados de entre Cecropina P1, protamina, Buforina I, Buforina II, Defensina, D-Magainina II, Cecropina A, Cecropina B, Lectina PA-1 y tripticina con o sin modificación en cuanto al contenido de aminoácidos, sales, ésteres, amidas, y sus formas aciladas. 9 ES 2 365 976 T3 ES 2 365 976 T3 11 ES 2 365 976 T3 12 ES 2 365 976 T3 13 ES 2 365 976 T3 14 ES 2 365 976 T3 ES 2 365 976 T3 16 ES 2 365 976 T3 17 ES 2 365 976 T3 18 ES 2 365 976 T3 19 ES 2 365 976 T3 ES 2 365 976 T3 21 ES 2 365 976 T3 22 ES 2 365 976 T3 23 ES 2 365 976 T3 24 ES 2 365 976 T3 ES 2 365 976 T3 26 ES 2 365 976 T3 27 ES 2 365 976 T3 28 ES 2 365 976 T3 29