MATERIALES FUNCIONALIZADOS CON NAD* O NADP* Y SU APLICACIÓN EN BIOSENSORES Y OTROS DISPOSITIVOS.

Materiales funcionalizados con NAD+ o NADP+ y su aplicación en biosensores y otros dispositivos electroquímicos.

La presente invención se refiere a un material funcionalizado que comprende un soporte sobre el que se fija un cofactor NAD+, NADP+, NADH o NADPH a través del grupo amino de la adenina mediante un grupo puente procedente de epóxidos. Dicho material está destinado a interaccionar con las enzimas cofactor dependientes en presencia del sustrato enzimático. Por sus propiedades, este material es útil como bio-electrodo para la elaboración de biosensores a base de enzimas deshidrogenasas así como bio-ánodo en biopilas.

La presente invención se refiere a un material con capacidad transductora que comprende un soporte sobre el que se fija un cofactor NAD+, NADP+, NADH o NADPH a través del grupo amino de la adenina mediante un grupo puente procedente de epóxidos. La ventaja clave de esta invención es que el cofactor en este caso no se 10 desnaturaliza, sino que está covalentemente inmovilizado y reacciona con las enzimas NAD(P+)-dependientes en presencia de un sustrato enzimático. Dicho material es adecuado para la obtención de biosensores y otros dispositivos electroquímicos como biopilas o celdas biocombustibles.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El desarrollo de métodos de inmovilización y regeneración de cofactores tipo nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) o nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) [también llamados difosfopiridina nucleótido o nucleótido fosfato o/y Co- 20 enzima I] ha sido objeto de un considerable interés científico y tecnológico en las últimas tres décadas. Este interés ha tenido un considerable carácter interdisciplinar debido al importante papel que juegan los dos cofactores de este tipo en la transferencia de electrones entre reacciones metabólicas redox y/o en el funcionamiento de varias enzimas llamados oxido-reductasas, deshidrogenasas o 25 enzimas NAD(P)+-dependientes. Así, se pueden destacar como ejemplos áreas como la bioelectroquímica, incluyendo la fabricación de biosensores, el desarrollo de celdas de biocombustible y la producción de bio-baterías, además de otras áreas menos afines como la de síntesis enzimática y la del desarrollo de procesos biotecnológicos para la purificación y la separación de enzimas.

Sin embargo la gran limitación a la hora de plantear estos desarrollos ha venido marcada por la dificultad de elaborar bioelectrodos funcionalizados con el cofactor NAD(P)+ y que este se encuentre accesible para las enzimas en juego, así como que sea reciclable en la superficie del electrodo de manera relativamente duradera.

Varios grupos de investigación en el área de bioelectroquímica han orientado sus esfuerzos a este objetivo. Se han descrito en la bibliografía ejemplos de inmovilización física del cofactor y de las enzimas en una matriz sol-gel (Th. Noguer, D.Szydlowska, J-L, Marty, M. Trjanowicz. Pol. J. Chem 78 (2004) pp. 1679-1689) y acetato de celulosa (S-D. Sprules, J-P. Hart, S-A. Wring, R. Pittson, Anal. Chim. Acta 304 (1995) pp. 74-24) mediante simple encapsulación, y otros químicos usando el 3- glicidoxipropiltrimetoxisilano para la inmovilización no orientada del cofactor NAD+ en una matriz tridimensional de sol-gel (Z. Wang, M. Etiennne, F. Quilés, G-W. Kohring, A. Walcarius. Biosens. Bioelectron 32 (2012) pp 111-117) o mediante la realización de enlaces covalentes gracias a grupos funcionales de polímeros como el dextrano (M. Montagné, J-L. Marty. Anal. Chem. Acta. 315 (1995) pp. 297-302), el polietilenglicol (K.K.W. Mak, U. Wollenberger, F.W. Scheller, R. Rennneberg. Biosens. Bioelectron 18 (2003) pp. 1059-1100), el quitosano (M. Zhang, C. Mullens, W. Gorski. Anal. Chem 79 (2007) pp. 2446-2450) o la polietilenamina (H. Zheng, J. Zhou, J. Zhang, R. Huang, H. Jia, S. Suye. Microchim. Acta 165 (2009) pp.109-115). Sin embargo, en la mayoría de esos diseños no se han tenido en cuenta varios factores de relevancia. Entre ellos es importante destacar lo siguientes: la conservación del estado nativo del cofactor, la probabilidad de accesibilidad de la enzima al sitio de unión en la estructura del cofactor; y el rendimiento de los biocomponentes introducidos en la matriz de inmovilización.

Para resolver estas limitaciones varios grupos pioneros han propuesto nuevas metodologías de inmovilización orientada del cofactor y de la enzima en varias etapas consiguiendo un diseño del biosensor similar al denominado layer-by-layer. En este contexto se han desarrollado diseños de bioelectrodos basados en cadenas moleculares enlazadas entre sí que consisten en secuencias de: electrodo/mediador químico/ cofactor/ enzimas. Sin embargo lo más destacado de estos trabajos es el diseño de un complejo de afinidad entre el cofactor y la enzima. En todos estos ejemplos ello se consiguió gracias a la inmovilización orientada del cofactor en su estado nativo mediante el ácido 3-aminofenilboronico que interacciona selectivamente con la unidad ribosa del cofactor. La ventaja que se esgrimido para este diseño es que se deja libre y accesible la unidad nicotinamida, lo que permite justificar una supuesta bioafinidad (Y-M. Yan, O. Yehezkeli, I. Willner. Chem. Eur. J. 13

(2007) pp. 10168-10175; B.L. Hassler, R.M. Worden. Biosens. Bioelectron 21 (2006) pp. 2146-2154). Sin embargo, dada la gran abundancia del grupo ribosa en la naturaleza y la debilidad del enlace hidrógeno establecido entre el grupo boro y los hidróxidos de la subunidad ribosa del NAD(P)+, a este sistema se le puede atribuir una 5 cierta inestabilidad en el funcionamiento en continuo, sobre todo en presencia de azúcares ya que esos compuestos pueden sustituir fácilmente el grupo ribosa y establecer otros enlaces hidrógeno con el átomo de boro. Por este motivo es fácil imaginar en este caso un inevitable desprendimiento del cofactor. Para corregir esas desventajas normalmente se intenta la inmovilización mediante entrecruzamiento de la 10 enzima.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

En esta invención se describe un nuevo método de inmovilización del cofactor NAD+, 15 NADP+, NADH o NADPH en su forma activa y de manera orientada. Mediante este

método de inmovilización se ha conseguido establecer enlaces químicos fuertes entre grupos funcionales del cofactor y de la superficie transductora sin dañar el centro de unión del cofactor-enzima.

A diferencia de otras aproximaciones del estado de la técnica, en la presente invención se ha modificado la superficie del sustrato por etapas produciendo de esta forma capas ordenadas de los componentes y aprovechando la gran afinidad que tienen las enzimas en cuestión al cofactor eficientemente inmovilizado y con su sitio de unión orientado hacia la enzima.

En esta invención se consigue la funcionalización de superficies transductoras de la señal física que actúa como sonda para obtener información en tiempo real del estado redox del cofactor en cuestión y para seguir el proceso biocatalítico, lo que hace que presente unas características idóneas para aplicarse a la fabricación de biosensores. 30 En el biosensor obtenido, los biocomponentes resultantes se encuentran en contacto íntimo con el transductor físico. Obviamente este diseño asegura una gran sensibilidad del sistema de medida y se puede aprovechar para utilizar la misma superficie en aplicaciones donde es necesario un reciclaje del mismo cofactor entre varias enzimas.

A diferencia de otros materiales biofuncionalizados similares descritos donde se describe la inmovilización orientada del cofactor NAD(P)+ mediante su subunidad ribosa y gracias al acido 3-aminofenilboronico que actúa como puente entre la superficie transductora y el cofactor, en esta invención se inmoviliza el cofactor 5 mediante el uso de grupos epóxicos que reaccionan con el grupo amina de la unidad adenina. En este caso se establecen enlaces químicos fuertes entre el cofactor y la superficie, lo cual conlleva enormes ventajas. Entre ellas la durabilidad, la flexibilidad y la posibilidad de aplicación de la superficie así funcionalizada en varias aplicaciones y diseños. Por ejemplo en este caso no es imprescindible la inmovilización de la enzima 10 y es posible la aplicación de la misma superficie para el control de varios procesos mediante varias enzimas.

Por tanto, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un material funcionalizado de fórmula general (I):

S-L-C

(I)

donde:

S es un soporte electródico,

L es un grupo puente que comprende el grupo de fórmula (II)

OH

(II)

C es un cofactor que se selecciona de entre NAD+, NADP+, NADH o NADPH, caracterizado porque C se une a L mediante un enlace covalente a través del grupo amino primario de la posición 6 de la adenina de C.

En la presente invención se entiende como soporte electródico un material sólido capaz de detectar y/o transmitir el flujo de electrones producido por los cambios de NAD(P+) a NAD(P)H o NAD+ a NADPH después de su reacción con una enzima 30 cofactor dependiente. Este soporte electródico es usado para transmitir señales físicas de cualquier tipo electroquímico, óptico, másica, magnética, etc.

Los soporte susceptibles de formar parte del material funcionalizado de la prese nte invención pueden ser: electrodos convencionales usad os en elect roquímica como electrodos de metales nobles (o ro, platino, plata,... [Seguir leyendo]

1. Material funcionalizado de fórmula general (I):

S-L-C

(I)

donde:

S es un soporte electródico,

L es un grupo puente que comprende el grupo de fórmula (II)

OH

(II)

C es un cofactor que se selecciona de entre NAD+, NADP+, NADH o NADPH, caracterizado porque C se une a L mediante un enlace covalente a través del grupo amino primario de la posición 6 de la adenina de C.

2. Material según la reivindicación 1 donde el soporte S se selecciona de entre metales nobles, materiales de carbono, óxidos de metales de transición, dopados o sin dopar, fibra óptica, polímeros, mica, vidrio, silicio o sílice.

3. Material según la reivindicación anterior donde el soporte se selecciona de entre oro, plata, platino o paladio.

4. Material según la reivindicación 2 donde el material se selecciona de entre nanotubos de carbono, grafito, grafeno, fullereno o microfibras de carbono.

5. Material según la reivindicación 2 donde el soporte es un óxido de estaño o zinc dopado con indio o flúor.

6. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el soporte se encuentra en forma de nanopartículas.

7. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el soporte comprende un recubrimiento adicional que se une al grupo puente L.

8. Material según la reivindicación 7 donde el recubrimiento es un polímero o mezcla 5 de polímeros.

9. Material según la reivindicación 7 donde el recubrimiento es una capa de silano sintetizada mediante sol-gel.

10. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además

comprende al menos una enzima unida al cofactor C.

11. Material según la reivindicación 10 donde la enzima es una deshidrogenasa.

12. Material según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde la enzima está

inmovilizada.

13. Material según la reivindicación anterior donde la enzima está inmovilizada mediante un reactivo de entrecruzamiento o mediante una membrana.

14. Procedimiento de obtención del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende las siguientes etapas:

a) epoxidación del sustrato S mediante un compuesto que comprende al menos un grupo de fórmula (III),

b) y adición de una disolución del cofactor C al producto obtenido en la etapa

(a),

donde S y C se definen como en la reivindicación 1.

15. Procedimiento de obtención del material cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13

que comprende las siguientes etapas:

a) epoxidación del cofactor C con un compuesto que comprende al menos un grupo de fórmula (III):

U"; O

b) y deposición del producto obtenido en la etapa (a) sobre un soporte S, donde C y S se definen como en la reivindicación 1.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 que además comprende una etapa c) de inmovilización de una enzima con afinidad por el cofactor C.

17. Procedimiento según la reivindicación anterior donde la enzima es una deshidrogenasa.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-17 donde el compuesto

utilizado en la etapa de epoxidación se selecciona de entre 3-

glicidoxipropiltrimetoxisilano, glicidol, epiclorhidrino, polietilenglicol diglicidil éter o 1,4-butanodiol diglicidil éter.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-18 en el que se une al soporte S un recubrimiento que comprende grupos funcionales activos.

20. Procedimiento según la reivindicación anterior donde los grupos funcionales activos se seleccionan de entre silanos, hidroxilos, aminas o carboxilos.

21. Uso del material funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de biosensores, bioelectrodos, biopilas, biobaterías o celdas de biocombustibles.

22. Biosensor que comprende el material funcionalizado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

23. Biopila que comprende el material funcionalizado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

24. Método para la determinación cualitativa y/o cuantitativa del sustrato de una enzima en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto dicha muestra con el biosensor de la reivindicación 22,

b) someter el biosensor a condiciones que resulten en una señal electroquímica,

c) medir la señal electroquímica obtenida en (b) y

d) determinar cualitativa y/o cuantitativamente el sustrato a partir de la medida de la señal electroquímica.

25. Método según la reivindicación 24 que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto el biosensor de la reivindicación 22 con una disolución de medida,

b) someter el producto obtenido en la etapa (a) a condiciones de transducción capaces de controlar el estado redox del compuesto C o la bio-afinidad de C con las enzimas C-dependientes,

c) inyectar a la disolución de medida una mezcla de enzimas, donde al menos una de ellas es C-dependiente,

d) seguir controlando y registrando la señal input indicativa del estado redox de C o de la sucesión de la bio-afinidad C enzima C-dependiente,

e) inyectar una muestra que contiene un sustrato a determinar y

f) correlacionar la diferencia entre las señales input obtenidas en la etapas d y e con la concentración del sustrato.

26. Método según la reivindicación 24 que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto el biosensor de la reivindicación 22 con una disolución de medida,

b) someter el producto obtenido en la etapa (a) a condiciones de transducción capaces de controlar el estado redox del compuesto C o la bio-afinidad de C con las enzimas C-dependientes,

c) seguir controlando y registrando la señal input indicativa del estado redox de C o de la sucesión de la bio-afinidad C enzima C-dependiente,

d) inyectar a la disolución de medida una mezcla de enzimas, donde al menos una de ellas es C-dependiente,

e) inyectar una muestra que contiene un sustrato a determinar y

f) correlacionar la diferencia entre las señales input obtenidas en la etapas d y e con la concentración del sustrato.