Materiales biológicos y usos de los mismos.

Una molécula de péptido aislada o recombinante que consiste en la secuencia:

(i) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD5 ;

Materiales biológicos y usos de los mismos

La presente invención se refiere a polipéptidos que se derivan de la chaperonina 6.1 y sus usos en el tratamiento de enfermedad y como agentes de alivio del dolor.

Los polipéptidos de choque térmico son una familia de moléculas encontradas en todos los organismos, cuya función es ayudar en el procesamiento biológico y estabilidad de moléculas biológicas (Zugel & Kauffman (1999) 1 Role of heat shock polypeptides in protection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microbiol. Rev. (12)1: 19-39; Ranford y col. (2) Chaperonins are cell signalling polypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol. Med., 15 de septiembre, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/215h.htm ).

Los polipéptidos de choque térmico se localizan en cualquier compartimento celular, y poseen la capacidad de 15 interaccionar con una amplia variedad de moléculas biológicas. En particular, los polipéptidos de choque térmico ayudan e influyen en el plegamiento de polipéptidos y la translocalización de polipéptidos en cualquier momento desde el ensamblaje hasta el desensamblaje del polipéptido y cualquier complejo de los mismos. La naturaleza colaboradora de los polipéptidos de choque térmico les ha conducido a que también sean conocidos como chaperonas moleculares (Laskey y col. (1978) Nucleosomes are assembled by an acidic polypeptide, which binds 2 histones and transfers them to DNA. Nature (275): 416-42).

Los polipéptidos de choque térmico se sintetizan por células en respuesta a estrés medioambiental, que incluye, pero no se limita a, cambios de temperatura (tanto aumentos como disminuciones), y señales patofisiológicas tales como citocinas. En respuesta al estrés medioambiental, los polipéptidos de choque térmico usan su capacidad para 25 procesar otros polipéptidos para proteger tales polipéptidos de cualquier desnaturalización que pueda producirse debido a la presencia del estrés. Este mecanismo también sirve para proteger células que contienen la proteína.

Los polipéptidos de chaperonina son un subgrupo de polipéptidos de choque térmico cuya función en el plegamiento de polipéptidos es muy conocida. Hay dos familias del polipéptido de chaperonina, las familias de la chaperonina 6 3 (aproximadamente 6 kDa) y de la chaperonina 1 (aproximadamente 1 kDa) (Ranford, 2). Las chaperoninas mejor caracterizadas son aquellas derivadas de E. coli, a partir de la cuales se ha establecido la estructura característica de la chaperonina 6 y la chaperonina 1. Los complejos de chaperonina de la mayoría de los otros organismos también se ajustan sustancialmente a esta estructura característica.

La estructura característica de las chaperoninas es un complejo formado a partir de dos anillos heptámeros (compuestos de siete monómeros de chaperonina 6) que están orientados el uno hacia el otro y están tapados por un anillo heptámero compuesto de monómeros de la chaperonina 1.

Convencionalmente, las chaperoninas ayudan en el plegamiento de polipéptidos cuando el polipéptido diana entra 4 en el núcleo central de los heptámeros en el anillo, y en la posterior liberación de energía de ATP el polipéptido diana se libera del núcleo central por un cambio conformacional en la estructura de chaperonina (Ranson y col. (1998) Artículo de revisión: Chaperones. Biochem. J (333): 233-242).

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) produce la chaperonina 6.1 (cpn 6.1), un polipéptido que se nombra 45 basándose en su identidad de secuencias de aminoácidos con otras chaperoninas conocidas. Adicionalmente, los polipéptidos de la chaperonina de M. tuberculosis son chaperonina 1 (cpn 1) y chaperonina 6.2 (cpn 6.2). La chaperonina 6.2 presenta el 59,6 % de identidad de secuencias de aminoácidos y el 65,6 % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos con la cpn 6.1.

La presente invención se refiere al uso de fragmentos de chaperonina 6.1 o moléculas funcionalmente equivalentes de Mycobacterium tuberculosis o procariotas relacionados en la prevención y/o tratamiento de afecciones tanto cancerosas como no cancerosas. Ejemplos de afecciones no cancerosas incluyen trastornos autoinmunitarios, osteoporosis, trastornos alérgicos o afecciones de inmunoactivación, particularmente asma, y/o afecciones tipificadas por una respuesta inmunitaria tipo linfocitos T colaboradores 2 (Th2) y/o afecciones asociadas a 55 eosinofilia y procedimientos de estimulación de la producción de mediadores de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, citocinas, in vitro o in vivo.

La autoinmunidad refleja la pérdida de tolerancia a sí mismo produciendo destrucción inapropiada de células normales o tejido. En muchas afecciones se encuentran autoanticuerpos, pero pueden reflejar un efecto en vez de

producir una enfermedad. En algunas enfermedades, sin embargo, los autoanticuerpos son la primera anomalía, principal, o solo detectable. Una clase de moléculas que participa a este respecto son las chaperoninas, que son altamente inmunógenas. Las chaperoninas pertenecen a un grupo de proteínas llamadas chaperonas moleculares que se unen a proteínas no nativas y las ayudan, en un procedimiento catalítico dependiente del ATP, a plegarse en 5 la forma tridimensional correcta requerida para una proteína funcional.

Se cree que las chaperoninas estimulan el sistema inmunitario a muchos niveles simultáneamente, que incluyen monocitos, macrófagos, células similares a fibroblastos, quizás otros tipos de células, y linfocitos T. Las defensas inmunitarias en mamíferos pueden dividirse en las defensas innatas y adaptativas. Aquellos que ya están en su 1 sitio, tales como fagocitos, linfocitos citolíticos espontáneos y complemento, se consideran innatos. En la exposición, la inmunidad adaptativa se activa en forma de linfocitos B y T. Las chaperoninas son conocidas por actuar directamente sobre los mecanismos de defensa innatos, particularmente sobre los fagocitos. También estimulan una poderosa respuesta inmunitaria adaptativa, concretamente la producción de anticuerpo y la estimulación de linfocitos T que en algunos casos puede ser protectora. En particular, inducen la secreción de citocinas que se cree que es 15 importante para las defensas del huésped. En algunos casos, sin embargo, se cree que la presencia de chaperoninas puede ser dañina para el huésped.

La función de las chaperoninas en la enfermedad autoinmunitaria es discutible. Aunque la infección/inmunidad con organismos que contienen chaperoninas es universal, y personas sanas tienen respuestas de linfocitos T a 2 chaperoninas propias, que incluye la producción de anticuerpos específicos de chaperoninas, la enfermedad autoinmunitaria clásica es bastante poco común. Así, la presencia de reacciones inmunitarias a chaperoninas puede ser casual y poco importante.

Sin embargo, la teoría de la imitación molecular sugiere la participación de chaperoninas en enfermedad 25 autoinmunitaria y se basa en el alto nivel de conservación de secuencias de aminoácidos entre chaperoninas de origen microbiano y de mamífero. La teoría propone que durante la infección con una amplia gama de microbios, los epítopes de chaperonina que son compartidos entre microbios y mamíferos estimulan los linfocitos T. Según esta teoría, un alto nivel de presentación de chaperoninas de epítopes de chaperoninas compartidos rompe la tolerancia a chaperoninas propias y se desarrolla enfermedad autoinmunitaria.

Se ha encontrado que las chaperoninas obtenidas de tumores producen efectos necróticos sobre aquellos tumores. Se sugiere que esto puede lograrse mediante el potenciamiento del reconocimiento inmunológico de antígenos tumorales, aunque el mecanismo de esto no se conoce. Por tanto, parece que las chaperoninas inducen inmunidad adaptativa protectora contra infección bacteriana y cáncer.

Las reacciones alérgicas, tales como asma, se refieren a respuestas inmunitarias proporcionalmente inapropiadas o erróneamente dirigidas. La prevalencia del asma, por ejemplo, está aumentando y todavía no se han encontrado terapias eficaces para tratar todos los casos. El actual tratamiento usa frecuentemente glucocorticosteroides inmunosupresores, agonistas beta, cromoglicato, modificadores del leucotrieno, etc., que tienen numerosos efectos 4 secundarios.

En tales reacciones alérgicas se producen altos niveles de IgE y las respuestas inmunitarias de linfocitos T colaboradores 2 (Th2) predominan con respecto a respuestas de Th1 produciendo una respuesta inflamatoria. Se cree que las respuestas de Th1 son principalmente protectoras contra infección microbiana y están promovidas por 45 citocinas, particularmente interleucina-12 (IL-12), IL-2 e interferón-y. A diferencia, las respuestas de Th2, en... [Seguir leyendo]

I.-Una molécula de péptido aislada o recombinante que consiste en la secuencia:

(i) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD;

2.- Una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que consiste en una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos:

(i) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD.

3.- Una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1 para su uso en medicina.

4.- Una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 para su uso en medicina.

5.- Una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1 para su uso en prevenir y/o tratar una afección no cancerosa o una afección cancerosa.

6.- Una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 para su uso en prevenir y/o tratar una 2 afección no cancerosa o una afección cancerosa.

7.- Una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

8.-Una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9.-Una molécula de péptido según la reivindicación 5 para su uso según la reivindicación 5 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en las que la afección no cancerosa está 3 seleccionada del grupo que comprende o que consiste en: trastornos autoinmunitarios tales como anemia hemolítica, trombocitopenia, tiroiditis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes autoinmune, miastenia grave, artritis, preferentemente artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, aterosclerosis y encefalitis autoinmune; afecciones alérgicas tales como eccema, dermatitis, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica; enfermedades alérgicas de las vías respiratorias; síndrome hipereosinofílico; dermatitis de contacto, alergia alimentaria; y 35 enfermedades respiratorias caracterizadas por inflamación eosinófila de las vías respiratorias e hiperreactividad de las vías respiratorias, tales como asma alérgica, asma intrínseca, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía eosinófila, bronquitis alérgica, bronquiectasia, asma ocupacional, síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílico, enfermedad pulmonar parasítica.

1.-Una molécula de péptido según la reivindicación 5 para su uso según la reivindicación 5 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en las que la afección cancerosa está seleccionada del grupo que comprende o que consiste en: tumores/tumores malignos en fase sólida, tumores localmente avanzados, sarcomas de tejido blando humanos, cáncer metastásico, que incluye metástasis linfáticas, tumores malignos de células sanguíneas que incluyen mieloma múltiple, leucemias agudas y crónicas, y linfomas, 45 cánceres de cabeza y cuello que incluyen cáncer de boca, cáncer de laringe y cáncer de tiroides, cánceres de pulmón que incluyen carcinoma de células pequeñas y cánceres de células no pequeñas, cánceres de mama que incluyen carcinoma de células pequeñas y carcinoma ductal, cánceres gastrointestinales que incluyen cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal y pólipos asociados a neoplasia colorrectal, cánceres pancreáticos, cáncer de hígado, cánceres urológicos que incluyen cáncer de vejiga y cáncer de próstata, 5 tumores malignos del aparato genital femenino que incluyen carcinoma de ovarios, cánceres uterinos (que incluyen de endometrio), y tumor sólido en el folículo ovárico, cánceres de riñón que incluyen carcinoma de células renales, cánceres cerebrales que incluyen tumores cerebrales intrínsecos, neuroblastoma, tumores cerebrales astrocíticos, gliomas, invasión de células tumorales metastásicas en el sistema nervioso central, cánceres de huesos que incluyen osteomas, cánceres de piel que incluyen melanoma maligno, progresión tumoral de queratinocitos cutáneos 55 humanos, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, hemangiopericitoma y sarcoma de Kaposi.

II.-Una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1 para su uso en el alivio de dolor.

12.- Una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 para su uso en el alivio de dolor.

13.- Una molécula de péptido o de ácido nucleico según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para su uso según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en las que el medicamento comprende además al menos un aditivo para

ayudar o aumentar la acción de la molécula de péptido o molécula de ácido nucleico.

14.- Una molécula de péptido o de ácido nucleico según la reivindicación 13 para su uso según la reivindicación 13, en las que el aditivo está seleccionado de al menos uno de paracetamol, aspirina, ibuprofeno, otros fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa-2 (ISC), opiáceos.

15.- Una molécula de péptido o de ácido nucleico según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para su uso según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en las que el dolor está seleccionado del grupo que comprende o que consiste en: dolor de espalda; cefalea; dolor de muelas; dolor de oído; artritis; gota; traumatismo de tejido blando; lesión traumática de ligamento y/o tendón; huesos rotos; cáncer; dolor posoperatorio; dolor menstrual; dolor

obstétrico; dolor de las vías urinarias; dolor visceral; quemaduras; abscesos; y otras infecciones.

16.- Una molécula de péptido según la reivindicación 5 para su uso según la reivindicación 5 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en las que la afección no cancerosa es una afección inflamatoria.

17.- Una molécula de péptido o de ácido nucleico según la reivindicación 16 para su uso según la reivindicación 16, en la que la afección inflamatoria es una afección inflamatoria aguda.

18. Una molécula de péptido o molécula de ácido nucleico según la reivindicación 17 para su uso según la 25 reivindicación 17, en las que la afección inflamatoria está seleccionada del grupo que consiste en: indicación

asociada a infección (tal como choque séptico, septicemia o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)), lesión por isquemia-reperfusión, letalidad por endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o resultante de la producción en exceso de citocinas tales como TNF o IL-1.

19.- Una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1 para su uso o una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 para su uso como un adyuvante.

2.- Un sistema de adyuvante que comprende (i) una molécula de péptido como se define en la reivindicación 1 o 35 una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 y (ii) un antígeno.

21.- El sistema de adyuvante según la reivindicación 2, en el que el antígeno está seleccionado del grupo que comprende o que consiste en: antígeno del carbunco; antígeno del cólera; antígeno diftérico; antígeno de Haemophilus influenzae b (Hib); antígeno de la hepatitis A; antígeno de la hepatitis B; antígeno de la gripe; antígeno

de la encefalitis japonesa; antígeno del sarampión, paperas y rubéola (SPR); antígeno meningocócico; antígeno de Pertussis\ antígeno neumocócico; antígeno de la poliomielitis; antígeno de la rabia; antígeno de la rubéola; antígeno de la viruela y/o de la variolovacuna; antígeno tetánico; antígeno de la encefalitis transmitida por garrapatas; antígeno de la tuberculosis; antígeno tifoideo; antígeno de la varicela/herpes zóster; antígeno de la fiebre amarilla; y antígeno de vacuna veterinaria.