LÍNEAS CELULARES Y SU USO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FÁRMACOS PARA EL CARCINOMA TIROIDEO.

Líneas celulares y su uso para la identificación de fármacos para el carcinoma tiroideo.

La presente invención se refiere al uso un sistema de líneas celulares de carcinoma tiroideo modificadas para expresar p27Kip1 exógeno en niveles estables o niveles inferiores de TNIP2 respecto de los niveles control, y al animal no humano que comprende dichas líneas. Además, la presente invención se refiere al uso de dichas líneas y dicho animal para el cribado de fármacos para el carcinoma tiroideo, así como a un kit que comprende dichas líneas.

Lineas celulares y su uso para la identificacion de farmacos para el carcinoma tiroideo. La presente invencion pertenece al campo de la Biologia Celular, la Biotecnologia y la Biomedicina, y se refiere al uso de lineas celulares de carcinoma tiroideo, modificadas para expresar p27Kip1 exogeno en niveles estables o inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control, y al animal no humano que comprende dichas lineas. Ademas, la presente invencion se refiere al uso de dicha linea y dicho animal para el cribado de farmacos para el carcinoma tiroideo.

ESTADO DE LA TECNICA

La busqueda de nuevos farmacos antitumorales esta actualmente determinada por las alteraciones moleculares identificadas en las celulas tumorales. Estas alteraciones definen un contexto molecular que hace que las celulas tumorales sean sensibles a unos compuestos determinados. La combinacion de los abordajes tradicionales con la informacion molecular actual permite el diseno de nuevos modelos celulares y animales para la busqueda de farmacos que eliminen selectivamente las celulas tumorales. Hasta la fecha, existen muchas dificultades para encontrar nuevos farmacos antitumorales especificos para eliminar exclusivamente las celulas con un contexto molecular determinado. En particular, es de especial interes encontrar farmacos antitumorales contra las celulas tumorales con un fenotipo mas agresivo, capaces de invadir otros tejidos y de provocar metastasis. El inhibidor 1B de quinasa dependiente de ciclina (CDKN1B, p27, KlP1 o p27Kip1) es una proteina codificada en humanos por el gen p27Kip1. Esta proteina pertenece a la familia de proteinas inhibidoras de quinasas dependientes de ciclinas. p27Kip1 interacciona con quinasas dependientes de ciclina (CDK, del ingles "eyelindependent kinases") , controla la progresion del ciclo celular en la fase G1 y suele considerarse una proteina inhibidora del ciclo celular, generalmente por inhibicion de CDK2, debido a que su principal funcion es frenar o ralentizar el ciclo de division celular. Sin embargo, p27Kip1 es capaz de activar CDK4. En W003063581 se estudian lineas celulares y animales transgenicos que contienen mutaciones en p27Kip1 que resultan en la perdida del sitio de fosforilacion de CDK2 y que tienen como consecuencia un aumento en el tamano de al menos una porcion del animal, que presenta tejidos agrandados o celulas mas grandes que los tejidos de los animales no transgenicos. En W02001051604 se describen animales recombinantes, entre ellos el raton, que contienen celulas con informacion genetica alterada y que sirven para identificar agentes antitumorales. Ademas, tambien se describe que la identificacion de los compuestos antiproliferativos puede ser realizada utilizando lineas celulares, preferentemente lineas celulares tumorales humanas con informacion genetica alterada, mas particularmente de genes supresores de tumores o de oncogenes, entre los que se incluye p27Kip1, aunque no se proporcionan ejemplos en este caso particular. La alteracion puede ser producida por expresion constitutiva de oncogenes o por interferencia de ARN para genes supresores de tumores. En W09924603 se describe un metodo de cribado de compuestos con actividad antitumoral donde se emplea un organismo con una alteracion en un gen que es analogo u homologo a un defecto primario tumoral. Una de las alteraciones estudiada es la perdida de expresion de p27Kip1 como contexto molecular tumoral para el cribado de farmacos. TNlP2 (de "TNFAIP3 interaeting protein 2") , tambien llamado 2KLlP, ABlN2 o FLlP1, es una proteina que se une al dominio de tipo dedo de zinc en el extremo carboxilo terminar de la proteina A20 (TNFAlP3) y esta involucrada en la activacion de la via de senalizacion de las quinasas ERK y MAPK, en varios tipos celulares. El papel de ABlN2 (TNlP2) en la regeneracion hepatica ha sido estudiada en ratones transgenicos con sobreexpresion de este gen (Li CC. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. 342 (1) :300-309) pero hasta la fecha no se ha estudiado el efecto de la represion de TNlP2 en modelos animales. Si se han generado lineas celulares donde la expresion de ABlN2 (TNlP2) esta inhibida mediante ARN de interferencia, con el objetivo de caracterizar la cascada de senalizacion en la que participa dicha molecula (Lang V. et al. Mol. Cell Biol. 2004. 24 (12) :5235-5248) . La obtencion de una linea celular primaria tiroidea que deriva de un carcinoma tiroideo papilar y su transfeccion para la sobreexpresion de p27Kip1 o la represion de la expresion de p27Kip1 mediante ARN de interferencia se describe en Bravo SB. et al. Anal Biochem 2010. 400 (2) :219-228. Sin embargo, este trabajo no estudia la agresividad de las lineas celulares modificadas.

Por tanto, no se ha descrito hasta la fecha ningun modelo celular ni animal como los que aporta la presente invencion para la identificacion de nuevos farmacos antitumorales, especialmente dirigidos a eliminar aquellas celulas que presenten un fenotipo mas agresivo y sean capaces de invadir otros tejidos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona nuevas lineas celulares y modelos animales basados en dichas lineas, que permiten el cribado de farmacos antitumorales.

Millones de personas sufren bocio, una enfermedad proliferativa de las celulas foliculares del tiroides que puede convertirse en neoplasica. Las neoplasias tiroideas tienen un bajo indice de proliferacion y una alta incidencia de metastasis. Los autores de la presente invencion han establecido cultivos primarios de celulas tiroideas humanas de distintas patologias proliferativas del tiroides, como son la enfermedad de Graves, el bocio multinodular, el adenoma folicular o el carcinoma papilar, ademas de metastasis de los nodulos linfaticos y de muestras de tejido de tiroides normal. El estudio de estos cultivos ha llevado a los autores a conocer el entorno molecular en el que las celulas del tiroides se vuelven cancerosas y adquieren un fenotipo de menor diferenciacion que las hace mas agresivas y les confiere una mayor capacidad metastasica.

Los autores han generado lineas celulares de carcinoma tiroideo papilar que expresan p27Kip1 exogeno o que tienen disminuida la expresion de TNlP2, y estas dos caracteristicas, sorprendentemente, tienen un mismo efecto en el comportamiento celular cuando son introducidas en un modelo animal no humano: provocan un aumento en la invasion de los tejidos adiposo y muscular cercanos. Esta caracteristica es de vital importancia puesto que implica que las celulas han adquirido la capacidad de migrar activamente y de atravesar barreras fisicas entre tejidos, lo que es clave en el pronostico de un cancer.

Es sobradamente conocido en el estado de la tecnica que p27Kip1 frena la inhibicion celular y que su delecion o inactivacion va asociada a mayores niveles de proliferacion celular, mayor tamano de los organos o del cuerpo y/o cancer. Sin embargo, los autores de la presente invencion describen que las celulas de carcinoma tiroideo son mas agresivas, tienen mayor capacidad invasiva y presentan un fenotipo mas maligno (con peor pronostico clinico) cuando son modificadas de forma que los niveles de p27Kip1 no pueden disminuir y se mantienen constantes en la celula.

Por tanto, los autores de la presente invencion presentan un nuevo modelo celular y animal para el cribado y la identificacion de nuevos farmacos antitumorales. Los modelos que aporta la presente invencion permiten discriminar el efecto de nuevas moleculas y compuestos sobre una poblacion de carcinoma tiroideo mas diferenciado, y otra mas agresiva y de mayor capacidad metastasica, es decir, permiten encontrar aquellos farmacos capaces de frenar la metastasis y combatir asi tumores mas agresivos de peor pronostico.

Las lineas celulares de la presente invencion estan modificadas geneticamente para expresar p27Kip1 exogeno y/o una ARN de interferencia de TNlP2. Estas modificaciones son las responsables de que las celulas tumorales presenten un fenotipo mas agresivo y tengan mayor capacidad de invasion de tejidos. Por tanto, la presente invencion proporciona nuevas herramientas para la identificacion de farmacos antitumorales especialmente dirigidos a celulas tumorales en estadios avanzados, con un fenotipo de menor diferenciacion que se asocia a una alta agresividad y capacidad de invadir otros tejidos, con mal pronostico clinico.

Por tanto, un primer aspecto de la invencion se refiere al uso de una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno, de una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control, o de ambas, para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo. En una realizacion preferida de la invencion, se usa una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno, es decir, que... [Seguir leyendo]

1. Uso de una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control o de dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1, para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.

2. Una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control.

3. La linea celular segun la reivindicacion anterior, caracterizada porque expresa un ARN de interferencia de TNlP2.

4. La linea celular segun la reivindicacion anterior, donde el ARN de interferencia es SEQ lD N0: 1.

5. Un kit que comprende una linea celular segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. El kit segun la reivindicacion anterior, que ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo control.

7. El kit segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, que ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1.

8. Uso del kit segun cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.

9. Uso del kit segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la obtencion de un animal no humano.

10. Uso de una linea celular segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o de dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1, para la obtencion de un animal no humano util para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.

11. Un animal no humano que comprende una linea de carcinoma tiroideo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o que comprende dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1.

12. El animal no humano segun la reivindicacion anterior, que ademas comprende una linea de carcinoma tiroideo control.

13. Uso del animal no humano segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores como modelo animal de cancer, especialmente para el cribado de farmacos.

14. Uso segun la reivindicacion anterior, donde el animal se usa como modelo animal de carcinoma tiroideo.

FIG. 1 A

FIG. 1 C

FIG. 2

FIG. 3 A

FIG. 3 B

FIG. 4

ES 2 397 874 Al

ES 2 397 874 Al

ES 2 397 874 Al