Una célula huésped transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:

1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana

CAMPO

Generalmente, la invención se refiere al campo de la farmacología. Más específicamente, la invención presenta líneas celulares estables, kits y métodos para predecir la absorción de productos químicos tales como fármacos, complementos nutritivos y productos químicos ambientales tras la administración a 5 animales o seres humanos.

ANTECEDENTES

Se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos en toda la memoria descriptiva. Cada una de estas publicaciones citadas se incorpora como referencia al presente documento, en su totalidad y para todos los fines. 10

La absorción de fármacos es la suma total de los efectos de diversos mecanismos mediante los cuales los fármacos pasan desde el punto de entrada hacia el torrente sanguíneo. La tasa y eficacia de absorción de fármacos afecta a la tasa y el grado en que un fármaco alcanza su sitio de acción pretendido. La absorción gastrointestinal de fármacos administrados por vía oral es, en parte, una función de la permeabilidad de la mucosa en el tracto gastrointestinal, particularmente en los intestinos, y también, en 15 parte, una función de la tasa de tránsito a través de los diversos órganos del tracto gastrointestinal ya que la tasa de tránsito establece la duración de tiempo en que el fármaco se ubica en un sitio de absorción.

Puede producirse la absorción intestinal de fármacos a través de diferentes vías. Muchos fármacos administrados por vía oral se absorben mediante difusión transcelular pasiva a través de la membrana celular de los enterocitos (Van Asperen J et al. (1998) Pharm. Res. 37: 429-35) o mediante difusión paracelular 20 pasiva a través de las uniones estrechas en el epitelio intestinal (Watson CJ et al. (2001) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281: C388-C397). La absorción epitelial de fármacos también está mediada por proteínas transportadoras de membrana (Lee VH (2001) J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 29: 41-4). Tales proteínas transportadoras también pueden servir como impedimento para la absorción de fármacos.

Se han descrito diversos transportadores de flujo de salida (o eflujo), incluyendo miembros de la 25 familia de proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MRP) (Borst P et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92: 1295-1302), glicoproteína P (P-gp) (Germann UA (1996) Eur. J. Cancer 32A: 927-44) y proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) (Staud F et al. (2005) Int. J. Biochem. Cell Biol. 374: 720-5; Doyle LA et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9526: 15665-70), entre otros. Se cree que tales proteínas transportadoras de flujo de salida son responsables principalmente de la absorción baja o variable de 30 fármacos administrados por vía oral (Stephens RH et al. (2001) J. Pharmacol. Exp. Ther. 296: 584-91).

Por tanto, la absorción de fármacos y los factores que lo facilitan o impiden son consideraciones importantes en el diseño de fármacos y en la evaluación de compuestos líderes como agentes terapéuticos potenciales. Varios modelos están disponibles para valorar la absorción en el intestino. Estos modelos incluyen el ensayo de permeabilidad en membranas artificiales paralelas (PAMPA), recirculación intestinal in 35 situ y perfusión de paso único, cámaras de Ussing y líneas celulares, incluyendo células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) y células Caco-2 (Balimane PV et al. (2006) AAPS J. 8: E1-13).

Las células Caco-2, que se derivaron de un adenocarcinoma de colon humano, son un modelo ampliamente usado para estudios de absorción intestinal. Cuando se hacen crecer y se permite que se diferencien, las células Caco-2 son morfológicamente similares a los enterocitos y expresan muchas de las 40 enzimas presentes en el borde en cepillo de la mucosa del intestino delgado, y por tanto se parecen mucho al entorno y las funciones del intestino delgado. Las células Caco-2 proporcionan una ventaja adicional para estudios de absorción intestinal porque expresan al menos tres proteínas transportadoras de flujo de salida del fármaco, incluyendo P-gp (Hunter J et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 14991-7), proteínas MRP (Hirohashi T et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292: 265-70; Gutmann H et al. (1999) Pharm. Res. (NY) 16: 402-7), y 45 BCRP (Xia CQ et al. (2005) Drug Metab. Dispos. 33: 637-43).

Para estudios de absorción de fármacos, es deseable evaluar las contribuciones de las proteínas transportadoras de flujo de salida de fármaco a la alteración de la absorción. Esto puede lograrse inhibiendo la expresión o actividad de los transportadores, particularmente P-gp. En general, se usan productos químicos tales como ciclosporina A para bloquear la actividad de P-gp. La inhibición química de 50 transportadores presenta una desventaja en la medida en que tales productos químicos también inhiben otras proteínas y funciones celulares, y por tanto pueden sesgar los resultados de experimentos de absorción. Recientemente, se mostró que la expresión de P-gp en células Caco-2 se reducía usando tecnología de ARNi (Watanabe T et al. (2005) Pharm. Res. 22: 1287-93), y se mostró que la expresión del gen resistente a múltiples fármacos 1 (MDR1) en células Caco-2 se reducía usando tecnología de ARNi (Celius T et al. (2004) 55 Biochem. Biophys. Res. Comm. 324: 365-71). La inhibición de la expresión de P-gp mediante ARNi potenció

la acumulación intracelular de y restauró la sensibilidad a compuestos transportados por P-gp (Wu H et al. (2003) Cancer Res. 63: 1515-19). Aunque la regulación por disminución genéticamente de P-gp en células Caco-2 representa una mejora con respecto al uso de inhibidores químicos, estudios de absorción de fármacos en este modelo están desfavorecidos porque el silenciamiento de la expresión de P-gp sola no tiene en cuenta las contribuciones de transportadores existentes tales como MRP y BCRP al flujo de salida de 5 fármacos y la alteración de la absorción. Además, el ARNhc sintetizado in vitro y transfectado directamente en células reduce la expresión génica sólo transitoriamente, y se restaura la expresión unos pocos días después de la transfección. Además, el ARNhc sintetizado in vitro también se limita a menudo a células que se transfectan fácilmente, y se sabe muy poco sobre la estabilidad de la inhibición de la expresión génica tras varios pases celulares. 10

Para evaluar y predecir con precisión la absorción intestinal de compuestos líderes, se desea que las contribuciones relativas de todas y cada una de las proteínas transportadoras de flujo de salida se tengan en cuenta y se controlen. De manera similar, es deseable producir y utilizar líneas celulares estables para controlar genéticamente la expresión y/o función de tales proteínas transportadoras de manera más permanente. La presente invención trata estas necesidades que se sentían hace largo tiempo. 15

SUMARIO

La invención presenta moléculas de ácido nucleico aisladas para inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, comprendiendo la molécula de ácido nucleico la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26 o variantes alélicas de ellas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de cadena sencilla, doble o triple. En algunos 20 aspectos preferidos, las moléculas de ácido nucleico son ARN.

También se proporcionan vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, o variantes alélicas de las mismas. En los vectores, la molécula de ácido 25 nucleico puede unirse operativamente a uno o más elementos reguladores tales como un promotor inducible o constitutivo. Los vectores pueden ser vectores virales, y en algunas realizaciones preferidas son vectores lentivirales.

También se proporcionan células huésped transformadas con tales vectores mediante esta invención. Se prefiere que tales células huésped elegidas para su transformación con los vectores expresen 30 al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana de tal manera que la transformación dará como resultado la inhibición de la expresión de la proteína. La proteína transportadora de flujo de salida de membrana puede ser cualquier proteína de este tipo. Los ejemplos de proteínas...

1. Una célula huésped transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 5

2. Una célula huésped según la reivindicación 1, expresando la célula una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

3. Una célula huésped según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, siendo la célula una célula epitelial intestinal.

4. Una célula huésped según cualquier reivindicación anterior, en la que la molécula de ácido 10 nucleico inhibe la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

5. Una célula huésped según la reivindicación 4, en la que las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P y proteína de resistencia al cáncer de mama.

6. Un cultivo celular que comprende una célula huésped según cualquier reivindicación anterior.

7. Un método in vitro para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal 15 que comprende inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos 20 sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; siendo dichas mediciones, en relación con los valores de referencia, predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula comprende transformar la célula con una 25 secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

9. Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la inhibición comprende transformar la célula con una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de dos o más proteínas 30 transportadoras de flujo de salida de membrana.

10. Un método in vitro para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal que comprende inhibir la expresión de una primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, inhibir la expresión de una 35 segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto las células primera y segunda con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera y segunda, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte 40 transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; en el que las mediciones indican la contribución relativa de la primera y segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana al transporte transcelular del compuesto de prueba y en el que dichas mediciones en relación con los valores de referencia son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal. 45

11. Un método según la reivindicación 10, en el que la primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama, y/o en el que la segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama. 50

12. Un método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que inhibir la primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la primera célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y/o en el que inhibir la segunda 55

proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la segunda célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además inhibir la 5 expresión de una tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una tercera célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto las células primera, segunda y tercera con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera, segunda y tercera, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de 10 referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; en el que las mediciones indican la contribución relativa de la primera, segunda y tercera proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana al transporte transcelular del compuesto de prueba y en el que dichas mediciones, en relación con los valores de referencia, son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el 15 organismo del animal.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que la tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama.

15. Un método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que inhibir la tercera 20 proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la tercera célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

16. Un método in vitro para inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo 25 de salida de membrana que comprende transformar una célula que expresa al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana con un vector lentiviral que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y expresar dicha molécula de ácido nucleico en 30 la célula, en el que la expresión de la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

17. Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 16, en el que la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama. 35

18. Un método según la reivindicación 16, en el que la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

19. Un método según la reivindicación 9 o la reivindicación 18, en el que las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P y proteína de resistencia al cáncer de mama. 40

20. Un método in vitro para identificar compuestos que inhiben la actividad de flujo de salida de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana que comprende inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto la primera célula con un sustrato de la proteína 45 transportadora de flujo de salida de membrana, poner en contacto una segunda célula que expresa la proteína transportadora de flujo de salida de membrana con un compuesto de prueba y un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, determinar la actividad de flujo de salida de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula, y en la segunda célula en presencia y ausencia del compuesto de prueba, y comparar las actividades de flujo de salida determinadas, 50 en el que una disminución en la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba en relación con la actividad de flujo de salida en ausencia del compuesto de prueba, y una identidad al menos parcial de la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba con la actividad de flujo de salida en la primera célula indica que el compuesto de prueba inhibe específicamente la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 55

21. Un método según la reivindicación 20, en el que inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula comprende transformar la primera célula

con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana.