Línea Celular MU-PH1.

La presente invención se refiere a la línea celular inmortalizada MU-PH1 derivada de un cultivo de células de Müller de retinas de ratones adultos depositada en la colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Tipo (DSMZ) con el número de depósito ACC3187,

al procedimiento de obtención de la línea celular y al uso de la misma para la evaluación de la eficacia de fármacos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o que cursan con la pérdida y/o muerte de fotorreceptores entre otros.

LÍNEA CELULAR MU-PH1 Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo general de la biotecnología y en particular se refiere a una línea celular inmortal denominada MU-PH1 (DSM ACC3187; October 24th, 2012), obtenida a partir de un cultivo de células de Müller de retinas de ratones adultos C57BL/6.

Estado de la técnica

En los peces y los anfibios las neuronas de la retina pueden regenerarse durante toda la vida del animal. Por el contrario, en los mamíferos el periodo de neurogénesis en la retina finaliza poco después del nacimiento, de tal forma que en caso de muerte de los fotorreceptores, estos no se pueden reemplazar, lo que supone una pérdida irreversible de la visión. Sin embargo, y a pesar de que no hay evidencias de que exista proliferación ni diferenciación de células madre, una pequeña cantidad de células madre y progenitoras persisten en el margen de la retina madura de mamíferos, lo que sugiere que el potencial neurogénico podría estar conservado (Ahmad, I., Tang, L., Pham, H., 2000. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun 270, 517-521; Martinez-Navarrete, G.C., Angulo, A., Martin-Nieto, J., Cuenca, N., 2008. Gradual morphogenesis of retinal neurons in the peripheral retinal margin of adult monkeys and humans. J Comp Neurol 511, 557-580). Este hecho hace pensar que se podría conseguir una terapia basada en la regeneración celular con células madre para restaurar la función visual en patologías oculares (MacLaren, R.E., Pearson, R.A., MacNeil, A., Douglas, R.H., Salt, T.E., Akimoto, M., Swaroop, A., Sowden, J.C., Ali, R.R., 2006. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature 444, 203-207). Para ello es necesario identificar primero los factores que regulan la capacidad proliferativa de las células progenitoras de la retina (Shechter, R., Ronen, A., Rolls, A., London, A., Bakalash, S., Young, M.J., Schwartz, M., 2008. Toll-like receptor 4 restricts retinal progenitor cell proliferation. J Cell Biol 183, 393-400).

En este sentido, y para determinar su potencial terapéutico, es importante entender los mecanismos celulares y moleculares implicados en la diferenciación y función de las células progenitoras de la retina. Diversos estudios apuntan a las células de Müller

como precursoras de los distintos tipos neuronales de la retina, dado que son capaces de regenerar distintos tipos de células tras una lesión. Así, las células de la glía de Müller podrían servir como células madre endógenas para reemplazar los fotorreceptores perdidos (Karl, M.O., Reh, T.A., 2010. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol Med 16, 193- 202.)

Las células de Müller y las neuronas retinianas comparten un progenitor común, lo que puede explicar por qué las células de Müller mantienen las propiedades de células madre neuronales y pueden transdiferenciarse en nuevas neuronas. En peces, las células de la glía de Müller son capaces de regenerar los bastones durante el crecimiento normal así como también todo tipo de células neuronales de la retina después de una lesión. En la transdiferenciación, las células de la glía de Müller, reinician el ciclo celular, proliferan y migran a la capa de fotorreceptores, donde comienzan a expresar marcadores específicos de fotorreceptores. En la retina de mamíferos un subconjunto de células de la glía de Müller muestra características de células madre (Martinez-Navarrete, G.C., Angulo, A., Martin-Nieto, J., Cuenca, N., 2008. Gradual morphogenesis of retinal neurons in the peripheral retinal margin of adult monkeys and humans. J Comp Neurol 511, 557-580). Sin embargo, su capacidad regenerativa está extremadamente limitada in vivo y por tanto, la muerte de los fotorreceptores da lugar a la pérdida de visión permanente (Wohl, S.G., Schmeer, C.W., Kretz, A., Witte, O.W., Isenmann, S., 2009. Optic nerve lesión increases cell proliferation and nestin expression in the adult mouse eye in vivo. Exp Neurol 219, 175-186). Las células de Müller de mamífero tienen potencial para desdiferenciarse in vitro en condiciones apropiadas y formar neuroesferas que se diferencian en células parecidas a las neuronas (Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S., Jones, M.F., Limb, G.A., 2011. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res 93, 852-861), pero se desconocen los mecanismos subyacentes a la incapacidad de estas células para comportarse como células madre en caso de degeneración de los fotorreceptores.

En este sentido, existen indicios que sugieren que los receptores tipo Toll (TLRs), que inducen la activación de la respuesta inmune innata, podrían jugar también un papel

importante en la proliferación de células progenitoras, puesto que diversos estudios los han relacionado con la proliferación de distintos tipos de células progenitoras (Shechter, R., Ronen, A., Rolls, A., London, A., Bakalash, S., Young, M.J., Schwartz, M., 2008. Toll-like receptor 4 restricts retinal progenitor cell proliferation. J Cell Biol 183, 393-400; Rolls, A., Shechter, R., London, A., Ziv, Y., Ronen, A., Levy, R., Schwartz, M., 2007. Toll-like receptors modulate adult hippocampal neurogenesis. Nat Cell Biol 9, 1081-1088; Lathia, J.D., Okun, E., Tang, S.C., Griffioen, K., Cheng, A., Mughal, M.R., Laryea, G., Selvaraj, P.K., ffrench-Constant, C., Magnus, T., Arumugam, T.V., Mattson, M.P., 2008. Toll-like receptor 3 is a negative regulator of embryonic neural progenitor cell proliferation. J Neurosci 28,13978-13984).

Debido al escaso número de células madre presentes en la retina, las líneas celulares pueden resultar muy útiles, ya que permiten obtener poblaciones importantes de células puras que facilitan el estudio de distintos procesos moleculares y celulares.

Se han obtenido líneas celulares inmortalizadas, bien mediante inmortalización espontánea o bien mediante la sobreexpresión constitutiva de oncogenes en células primarias. A pesar de que las líneas celulares inmortales constituyen una buena herramienta para el estudio de procesos básicos, la inmortalización permanente altera las características innatas de las células primarias e incrementa el riesgo de generación tumoral cuando son usadas en trasplante in vivo.

Existe pues la necesidad de caracterizar y proporcionar una nueva línea celular inmortal que suponga un buen modelo de estudio de la función de los fotorreceptores tanto in vitro como in vivo, que permita estudiar los defectos visuales relacionados con el daño a los fotorreceptores y supere todos los problemas descritos en el estado de la técnica.

Descripción de la invención

La presente invención soluciona los problemas del estado de la técnica. Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una línea celular inmortalizada MU-PH1 (de ahora en adelante, línea celular de la presente Invención) derivada de un cultivo de células de Müller de retinas de ratones adultos depositada el 24 de octubre de 2012, en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos tipo según el Tratado de Budapest con el número de depósito DSM ACC3187.

Concretamente la línea celular de la presente invención se caracteriza por que:

- expresa los marcadores de células neurales y de células progenitoras: nestina, a-tubulina, p-lll-tubulina, Abcg2, y AscM;

- expresa los fotopigmentos: rodopsina, opsinas de conos (azul y roja/verde) y

melanopsina;

- expresa los fotorreceptores: recoverina y transducina de conos;

- expresa los receptores tipo toll: TLR2;

- no expresa marcadores de células bipolares, amacrinas y astrocitos;

- es capaz de formar neuroesferas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener la línea celular de la presente invención que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar las retinas en DMEM suplementado, 5% C02 a 37°C,

b) llevar las células hasta semiconfluencia,

c) purificación del cultivo por afinidad,

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la línea celular de la presente invención para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la línea celular de la presente invención para medicina regenerativa. En otro aspecto en particular, la presente invención se refiere a la línea celular de la presente invención para el tratamiento de 20 enfermedades neurodegenerativas de la retina.

En la presente invención por enfermedades neurodegenerativas de la retina nos referimos a la retinosis pigmentaria, retinopatía diabética, distrofia... [Seguir leyendo]

1. Línea celular inmortalizada MU-PH1 derivada de un cultivo de células de Müller de retinas de ratones adultos depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Tipo (DSMZ) con el número de depósito ACC3187.

2. Línea celular según la reivindicación 1, caracterizada porque:

- expresa los marcadores de células neurales y de células progenitoras: nestina, a-tubulina, p-lll-tubulina, Abcg2, y AscM;

- expresa los fotopigmentos: rodopsina, opsinas de conos y

melanopsina;

- expresa los fotorreceptores: recoverina y transducina;

- expresa los receptores tipo toll: TLR2;

- expresa los receptores de melatonina MTi y MT2;

- no expresa marcadores de células bipolares, amacrinas y astrocitos.

3. Línea celular según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 caracterizada por que 15 forma neuroesferas.

4. Procedimiento para la obtención de una línea celular inmortalizada MU-PH1 según las reivindicaciones 1-3 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar las retinas en DMEM suplementado, 5% C02 a 37°C,

b) llevar las células hasta semiconfluencla,

c) purificación de las células microgliales de retina mediante técnicas de afinidad inmunológica,

5. Línea celular inmortalizada MU-PH-1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.

6. Línea celular inmortalizada MU-PH-1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 25 para medicina regenerativa.

7. Línea celular inmortalizada MU-PH1 según la reivindicación 6 para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina.

8. Línea celular inmortalizada MU-PH1 según la reivindicación 7, donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina son retinosis pigmentaria, retinopatía

diabética, distrofia de conos, degeneración macular asociada a la edad, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Usher, glaucoma, neurodegeneración de la retina, alteraciones visuales asociadas a la enfermedad de Parkinson y distrofias retinianas en general.

9. Línea celular inmortalizada MU-PH1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 10 para la evaluación de la eficacia de fármacos para el tratamiento de enfermedades

neurodegenerativas o que cursan con la pérdida y/o muerte de fotorreceptores.

10. Composición que comprende células de la línea celular inmortalizada MU-PH1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente.

11. Uso de una línea celular inmortalizada MU-PH1 según cualquiera de las 15 reivindicaciones 1-3 o de una composición según la reivindicación 10 para la

elaboración de un medicamento para medicina regenerativa.

12. Uso según la reivindicación 11, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina.

13. Uso según la reivindicación 12, donde las enfermedades neurodegenerativas de la 20 retina son retinosis pigmentaria, retinopatía diabética, distrofia de conos, degeneración

macular asociada a la edad, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Usher, glaucoma, neurodegeneración de la retina, alteraciones visuales asociadas a la enfermedad de Parkinson y distrofias retinianas en general.