Línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados.

Un cultivo organotípico que comprende una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados,

endonde la línea celular comprende un complemento cromosómico normal de 46 con la excepción de unisocromosoma extra en el brazo largo del cromosoma 8 y en donde el cultivo organotípico reproduce la arquitecturadel tejido del epitelio escamoso estratificado humano normal.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06003693.

Solicitante: WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 614 NORTH WALNUT STREET MADISON, WI 53705-7365 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ALLEN-HOFFMANN, LYNN, SCHLOSSER, SANDRA, J., PICKART, MICHAEL, A.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/50 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).

PDF original: ES-2384264_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Queratinocitos humanos Los queratinocitos humanos aislados a partir de epitelios escamosos estratificados se pueden cultivar fácilmente in vitro (revisado por Leigh, y col., 1994) . Los queratinocitos cultivados se replican fácilmente durante los pases iniciales y pueden generar un alto número de células que muestran ciertas características de diferenciación escamosa in vivo. Cuando los queratinocitos humanos normales, cultivados se trasplantan a ratones, la estructura del tejido epidérmico se regenera con el tiempo de forma ordenada (Breitkreutz, y col., 1997) . La comodidad del cultivo y del trasplante de los queratinocitos humanos, junto con la accesibilidad de la piel para el proceso de trasplante y la posterior vigilancia, hacen que este tipo celular somático sea atractivo para la entrega de genes terapéuticos. Sin embargo, debido al inicio de la diferenciación terminal, la expresión transgénica en los queratinocitos se pierde sistemáticamente, independientemente de la estrategia empleada para la expresión génica. Diversos informes han mostrado que los queratinocitos humanos modificados por ingeniería genética pueden reproducir una epidermis de espesor completo, demostrando de este modo que células con propiedades similares a las células pluripotenciales, estaban presentes en la población de células trasplantadas (Choate y Khavari, 1997; Choate y col., 1996; Gerrard y col., 1993; Garlick, y col., 1991; Greenhalgh y col., 1994; Vogel, 1993, Fenjves, 1994) .

Ensayos de cultivo de tejidos in vitro empleando células humanas obtenidas a partir de epitelios escamosos estratificados Ensayos in vitro que empleen cultivos monocapas de células adherentes que mantengan el entorno del tejido normal in vivo, no existen para los tejidos humanos. Los modelos animales tienen la capacidad de imitar algunos de los procesos implicados en la respuesta de las terapias en tejidos humanos. Sin embargo, los sistemas animales sólo se prestan ellos mismos para puntuar de forma cualitativa y subjetiva la repoblación tumoral. Históricamente, los ensayos aislados de crecimiento in vitro han empleado cultivos monocapas de líneas celulares de roedor o humanas sobre placas de plástico para el cultivo de tejidos. El tamaño de las colonias o el número de células se determinan para estimar el grado de supervivencia y de repoblación de las células cancerígenas, después de un tratamiento con radiación. Un inconveniente principal de este planteamiento es que no tiene en cuenta ninguna señal de los factores de crecimiento adhesivo o paracrino en el entorno de la célula tumoral. Por esta razón, los estudios del crecimiento de células tumorales en ausencia de un tejido normal que las envuelva, no pueden reflejar de forma precisa las características del crecimiento in vivo en células tumorales.

Por ejemplo, los tumores de cabeza y cuello humanos (H&N, del inglés “head and neck”) se diagnostican cada año en 43.000 pacientes en los Estados Unidos y en más de 750.000 pacientes en el mundo entero. Aunque la reaparición de los tumores cerca del sitio del tumor primario es la causa predominante de un fallo del tratamiento y de la muerte de estos pacientes, se conoce poco acerca de los acontecimientos moleculares que contribuyen al crecimiento de nuevo de los tumores después del tratamiento. Evidencias clínicas y radiobiológicas sugieren que las tasas de proliferación tumoral se pueden incrementar realmente después de las lesiones debidas a la exposición a la radiación (Hall, EJ, 1988; Pretereit, DG, y col., 1995) . Se ha sugerido que el entorno de la herida proporciona señales potentes para el crecimiento tumoral (Haddow, A., 1972) . Por ejemplo, la glicoproteína de la matriz extracelular (ECM) presente en el lecho de la herida, proporciona y/o secuestra estímulos potentes de crecimiento, que son necesarios para la regeneración del tejido normal. A través de estas observaciones queda claro que el entorno del tejido en el que un tumor se desarrolla inicialmente y/o crece de nuevo, después de un tratamiento fallido anulado, puede tener un impacto significativo sobre el crecimiento tumoral.

Boukamp y col., J. Cell Biology, 1988, vol. 106, págs. 761-771, describen la queratinización normal en una línea celular de queratinocitos humanos aneuploides.

Allen-Hoffmann y col., Int. J. Oncology, 1993, vol. 3, págs. 619-625, describen el uso de queratinocitos humanos inmortalizados RHEK-1 para la detección de una mutación inducida.

En la técnica de la biología celular se necesita una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados de forma espontánea con un complemento cromosómico casi normal y un método para emplear esta línea celular inmortalizada en un ensayo con en tejidos in vitro.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización, la presente invención es un cultivo organotípico que comprende una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados, en donde la línea celular comprende un complemento cromosómico normal de 46 con la excepción de un isocromosoma extra en el brazo largo del cromosoma 8 y en donde el cultivo organotípico reproduce la arquitectura del tejido del epitelio escamoso estratificado humano normal.

En otra realización, la presente invención es un cultivo organotípico de la invención transfectado con un gen heterólogo. Este gen puede ser un gen marcador, lo más preferentemente una proteína verde fluorescente (GFP) .

La presente invención es también a un método para ensayar el efecto de un agente de modulación celular, que comprende las etapas de:

(a) obtener un cultivo organotípico que comprende una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados, en donde la línea celular comprende un complemento cromosómico normal de 46 con la excepción de un isocromosoma extra en el brazo largo del cromosoma 8 y en donde el cultivo organotípico reproduce la arquitectura del tejido del epitelio escamoso estratificado humano normal

(b) tratar el cultivo con un agente de modulación celular, y

(c) evaluar las células dentro del cultivo.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes después del estudio de la memoria descriptiva, las reivindicaciones y los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE DIVERSOS ASPECTOS DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un análisis cromosómico de las células BC-1-Ep/SL. El análisis cariotípico se realizó en células BC-1-Ep/SL en el pase 31. Las células contenían 47 cromosomas debido a un isocromosoma extra del brazo largo del cromosoma 8. El cromosoma extra, i (8q) , no se observa en los queratinocitos parentales (pase 3 de BC-1-Ep) que mostraba un cariotipo de macho normal.

La Fig. 2 muestra la necesidad de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para los pases en serie de las células BC-1-Ep/SL. Las células BC-1-Ep/SL se sometieron a pases en serie en medios convencionales +/- 10 ng/ml de EGF. Las células sobrevivían sin EGF pero crecían de forma insatisfactoria.

La Fig. 3 muestra que el factor de crecimiento transformante º-1 (TGF-º1) inhibe el crecimiento de los queratinocitos BC-1-Ep/SL. Las células parentales, BC-1-Ep (6º) y BC-1-Ep/SL (28º) se extendieron en placas en medios convencionales sin EGF o una capa alimentadora 3T3. Las células se trataron con +/- 5 ng/ml de TGF-º1 cuando las células eran ~20% confluentes en medios convencionales sin EGF. Se hizo un recuento de las células 3-5 días más tarde. El efecto del tratamiento con TGF-º1 se muestra como un porcentaje de testigos.

La Fig. 4 muestra los requerimientos de factores de crecimiento para las células BC-1-Ep/SL. Las células BC-1-Ep/SL en el pase 31, se dejaron crecer en 2, 5 % de FCS + 3 F12:1 DME + 10 ng/ml de EGF suplementado con ausencia de factores de crecimiento adicionales (-GF) , 0, 4 !g/ml de hidrocortisona (HC) , 8, 4 ng/ml de toxina colérica (CT) , 24 !g/ml de adenina (Ade) , 5 !g/ml de insulina (Ins) o todos los factores de crecimiento (+GF) . El crecimiento celular se incrementaba en presencia de cada factor de crecimiento por separado, sin embargo, se consiguió un crecimiento óptimo en presencia de todos los factores de crecimiento.

La Fig. 5 muestra que la confluencia celular incrementada reduce la eficacia de la transfección transitoria en células BC-1-Ep/SL. Células BC-1-Ep/SL se transfectaron con el plásmido que contenía GFP, pGreenLantern (Gibco) y pcDNA3 neo (Invitrogen) , empleando GeneFECTOR (VennNova... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un cultivo organotípico que comprende una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados, en donde la línea celular comprende un complemento cromosómico normal de 46 con la excepción de un isocromosoma extra en el brazo largo del cromosoma 8 y en donde el cultivo organotípico reproduce la arquitectura del tejido del epitelio escamoso estratificado humano normal.

2. El cultivo de la reivindicación 1, en el que la línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados se transfecta con un gen heterólogo.

3. El cultivo de la reivindicación 2, en el que el gen heterólogo es un gen marcador.

4. El cultivo de la reivindicación 3, en el que el gen marcador codifica la proteína verde fluorescente.

5. Un método para ensayar el efecto de un agente de modulación celular, que comprende las etapas de:

(a) obtener un cultivo organotípico que comprende una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados, en donde la línea celular comprende un complemento cromosómico normal de 46 con la excepción de un isocromosoma extra en el brazo largo del cromosoma 8 y en donde el cultivo organotípico reproduce la arquitectura del tejido del epitelio escamoso estratificado humano normal, (b) tratar el cultivo con un agente de modulación celular, y (c) evaluar las células dentro del cultivo.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la etapa (c) es una evaluación del crecimiento celular.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la evaluación de crecimiento ceular se hace mediante separación celular activada por fluorescencia.

8. El método de la reivindicación 5, en el que los queratinocitos humanos están marcados genéticamente.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el marcador es proteína verde fluorescente.

10. El método de la reivindicación 5, en el que la evaluación de la etapa (c) es de la forma o tamaño celular.

 

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