Ligando de ácido nucleico que se une específicamente y con afinidad elevada a la proteína C5 del Sistema de Complemento y que es un inhibidor de la división de la proteína C5 en C5a y c5b,

en el que dicho ligando comprende la secuencia:

CGCCGCGGUCUCAGGCGCUGAGUCUGAGUUUACCUGCG

o una secuencia que tiene un grado de homología primaria de secuencia superior a un 80%

Ligandos de ácido nucleico de afinidad elevada de la proteína C5 del sistema de complemento.

Campo de la invención

En la presente invención se describen métodos para identificar y preparar ligandos de Ácido nucleico de afinidad elevada para Proteínas del Sistema de complemento. El método utilizado aquí para identificar dichos Ligandos de Ácido Nucleico se denomina SELEX^TM, un acrónimo para la Evolución Sistemática de Ligandos mediante enriquecimiento Exponencial. En la presente invención se describen métodos para identificar y preparar ligandos de Ácido nucleico de afinidad elevada para Proteínas del Sistema de complemento C5. La presente invención incluye Ligandos de Ácido Nucleico de afinidad elevada de C5. También se describen ligandos de ARN de C5. También se describen Ligandos de Ácido Nucleico que inhiben y/o activan el Sistema de complemento. Los oligonucleótidos de la presente invención son útiles como agentes farmacéuticos o de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

El sistema de complemento comprende un grupo de por lo menos 20 proteínas plasmáticas y de membrana que actúan conjuntamente en un sistema n casada regulado para atacar formas extracelulares de patógenos (Janeway et al. (1994) Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. Current Biology Ltd, San Francisco, pp. 8:35-8:55; Morgan (1995) Crit. Rev. in Clin Lab. Sci. 32(3):265-298). Existen dos cascadas de activación enzimática distintas, los mecanismos clásico y alternativo, y un mecanismo no enzimático conocido como mecanismo de ataque de membrana.

El mecanismo clásico es desencadenado habitualmente por un anticuerpo unido a una partícula exógena. Comprende diversos componentes C1, C4, C2, C3 y C5 (indicados por orden en el mecanismo). El inicio del mecanismo clásico del Sistema de complemento aparece tras la unión y activación del primer componente del complemento (C1) por los activadores inmune y no inmune (Cooper (1985) Adv. Immunol. 37:151). C1 comprende un complejo dependiente de calcio de los componentes C1q, C1r y C1s, y es activado a través de la unión del componente C1q. C1q contiene seis subunidades idénticas y cada subunidad comprende tres cadenas (las cadenas A, B y C). Cada cadena tiene una región de cabeza globular que está conectada a una cola de tipo colágeno. La unión y activación de C1q por los complejos antígeno-anticuerpo tiene lugar a través de la región de cabeza globular de C1q. Numerosos activadores de C1q que no son anticuerpos, incluyendo proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Reid et al. (1993) The Natural Immune System: Humoral Factors. E. Sim. ed. IRL Press, Oxford. p. 151) se unen y activan a través de un sitio distinto en la región de la cola de tipo colágeno.

Los activadores C1q que no son anticuerpos incluyen la proteína C reactiva (CRP) (Jiang et al. (1991) J. Immunol. 146: 2324) y la proteína amiloide del plasma (SAP) (Bristow et al. (1986) Mol. Immunol. 23; 1045); éstos activarán C1q cuando se agregan mediante la unión a fosfolípido o carbohidrato, respectivamente. CRP o SAP monoméricas no activan C1q. C1q también se activa a través de la unión al péptido amiloide agregado (Schultz et al. (1994) Neurosci. Lett. 175:99: Snyder et al. (1994) Exp. Neurol. 128:136), un componente de placas observado en la enfermedad de Alzheimer (Jiang et al. (1994) J. Immunol.152:5050; Eikelenboom y Stam (1982) Acta Neuropathol (Berl) 57:239: Eikelenboom et al. (1989) Virchows Arch. [B] 56:259: Rogers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10016: Dietzschold et al. (1995) J. Neurol. Sci. 130:11). La activación de C1q podría agravar el tejido dañado asociado con la enfermedad de Alzheimer. Estos activadores se unen a C1q en su región de tipo colágeno, distante de la región del grupo de cabeza donde se unen los activadores de inmunoglobulina. Otras proteínas que se unen a la región de tipo colágeno de C1q incluyen colágeno (Menzel et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 670:265), fibronectina (Reid et al. (1984) Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 92 (Suppl. 284):11), laminina (Bohnsack et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3824), fibrinógeno y fibrina (Entwistle et al. (1988) Biochem. 27:507), rsgp41 de VIH (Stoiber et al. (1995) Mol. Immunol. 32:371), actina (Nishioka et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:1307) y glicoproteína del tabaco (Koethe et al. (1995) J. Immunol. 155:826).

C1q también se une y se puede activar por carbohidratos aniónicos (Hughes-Jones et al. (1978) Immunology 34: 459) incluyendo mucopolisacáridos (Almeda et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:785), fucanos (Blondin et al. (1994) Mol. Immunol. 31:247), proteoglicanos (Silvestri et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:7383), y por lípidos incluyendo lipopolisacáridos (LPS) (Zohair et al. (1989) Biochem. J. 257:865; Stoiber et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:294). Tanto el ADN (Schravendijk y Dwek (1982) Mol. Immunol. 19:1179: Rosenberg et al. (1988) J. Rheumatol 15:1091; Uwatoko et al. (1990) J. Immunol. 144:3484) como el ARN (Acton et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3530) también se pueden unir y potencialmente activar C1q. Los componentes intracelulares que activan C1q incluyen membranas celulares y subcelulares (Linder (1981) J. Immunol. 126:648: Pinckard et al. (1973) J. Immunol. 110:1376; Storrs et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:10924; Giclas et al. (1979) J. Immunol. 122:146; Storrs et al. (1983) J. Immunol. 131:416), filamentos intermedios (Linder et al. (1979) Nature 278:176) y actina (Nishioka et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:1307). Todas estas interacciones utilizarían el mecanismo clásico para la protección contra infección bacteriana (o viral) o como respuesta al daño en el tejido (Li et al. (1994) J. Immunol. 152:2995) en ausencia de anticuerpo.

Un sitio de unión para los activadores que no son anticuerpos incluyendo CRP (Jiang et al. (1991) J. Immunol. 146:2324), SAP (Ying et al. (1993) J. Immunol. 150:169), peptide amiloide (Newman (1994) Curr. Biol. 4:462) y ADN (Jiang et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:25597) se ha localizado en el extremo amino de la cadena A de C1q en los residuos 14-26. Un péptido sintético que comprende esta secuencia inhibe de manera eficaz tanto la unión como la activación. El péptido 14-26 contiene diversos residuos básicos y se empareja con uno de los motivos de unión de heparina (Yabkowitz et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:10888: Cardin et al. (1989) Arteriosclerosis 9:21). El péptido es también altamente homogéneo con el péptido 145-156 acetilcolinesterasa con cola de colágeno: este sitio se asocia con la unión a membrana basal de sulfato de heparina (Deprez et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:11043). También puede estar implicado un segundo sitio de la cadena A de Ciq en los residuos 76-92 en una unión más débil; este sitio está en la unión de la región de cabeza globular y la cola de tipo colágeno.

La segunda cascada enzimáticamente activada, conocida como mecanismo alternativo, es una ruta rápida independiente de anticuerpos para la activación y amplificación del Sistema de complemento. El mecanismo alternativo comprende diversos componentes: C3, Factor B y Factor D. La activación del mecanismo alternativo tiene lugar cuando C3b, una forma por división proteolítica de C3, se une a una superficie activante, tal como una bacteria. El Factor B se une a entonces a C3b y se divide por el Factor D para producir la enzima activa, Ba. La enzima Ba divide entonces más C3 a C3b, produciendo una deposición amplia de complejos C3b-Ba en la superficie activante. Cuando se deposita un segundo C3b, que forma un complejo C3b-C3b-Ba, la enzima puede dividir entonces C5 y desencadenar la activación del mecanismo terminal.

El mecanismo terminal no enzimático, también conocido como mecanismo de ataque de membrana, comprende los componentes C5, C6, C7, C8 y C9. La activación de este mecanismo de ataque de membrana tiene lugar cuando el componente C5 es dividido enzimáticamente por el mecanismo clásico o alternativo para producir el polipéptido pequeño C5a (9 kDa) y el fragmento C5b grande (200 kDa). El polipéptido C5a se une a un receptor acoplado a la proteína G de 7 transmembrana que se describió originalmente en leucocitos y ahora se sabe que se expresa en un conjunto de tejidos que incluyen hepatocitos (Haviland et al. (1995) J. Immunol. 154:1861) y neuronas (Gasque et al. (1997) Am. J. Pathol. 150:31). La molécula...

1. Ligando de ácido nucleico que se une específicamente y con afinidad elevada a la proteína C5 del Sistema de Complemento y que es un inhibidor de la división de la proteína C5 en C5a y c5b, en el que dicho ligando comprende la secuencia:

CGCCGCGGUCUCAGGCGCUGAGUCUGAGUUUACCUGCG

o una secuencia que tiene un grado de homología primaria de secuencia superior a un 80%.

2. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ligando de ácido nucleico es ARN.

3. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el ligando de ácido nucleico es de cadena única.

4. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ligando de ácido nucleico está químicamente modificado.

5. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que la modificación química se elige entre:

(i) modificaciones de azúcar en posición 2';

(ii) modificaciones de pirimidina en posición 5;

(iii) modificaciones de purina en la posición 8;

(iv) modificación en aminas exocíclicas;

(v) sustitución de 4-tiouridina;

(vi) sustitución de 5-bromo-uracilo;

(vii) sustitución de 5-yodo-uracilo;

(viii) modificaciones del esqueleto;

(ix) modificaciones de fosforotioato;

(x) modificaciones de alquil fosfato;

(xi) metilaciones;

(xii) terminación de cadena en 3';

(xiii) terminación de cadena en 5'.

6. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-fluoro (2'-F).

7. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-O-metilo (2'-OMe).

8. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-amino (2'-NH₂).

9. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que todas las bases pirimidina son 2'-fluoro (2'-F).

10. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que G5, G 17 y A32 son 2'-OH.

11. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando tiene una terminación de cadena en 3'.

12. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando tiene una unión fosfodiéster z3'-3' invertida en el extremo 3'.

13. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el ligando tiene una terminación de cadena en 5'.

14. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 90%.

15. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 95%.

16. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 99%.

17. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha secuencia se elige entre una de las SEC ID No. 190, 191, 192, 194, 195, 196.

18. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho ligando de ácido nucleico se elige entre una de SEC ID No. 190, 191, 192, 194, 195, 196.

19. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID No. 196 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la proteína C5 e inhibir la división de la proteína C5 en C5a y C5b que SEC ID No. 196.

20. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID NO: 196.

21. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID No. 194 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la proteína C5 e inhibir la división de la proteína C5 en C5a y C5b que SEC ID No. 194.

22. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una estructura "stem"-bucle.

23. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 22, en el que la estructura "stem"-bucle tiene un saliente UUU.

24. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el ligando está unido covalentemente con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o un compuesto lipofílico.

25. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 24, en el que el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es un polialquilenglicol.

26. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 25, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG).

27. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 26, en el que el PEG tiene un peso molecular de 10 - 80 KDa.

28. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 26, en el que el PEG tiene un peso molecular de 20 - 45 KDa.

29. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está purificado y aislado.

30. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es un inhibidor de la activación del Sistema de Complemento.

31. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína C5 es proteína C5 humana.

32. Fármaco que comprende un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

33. Fármaco según la reivindicación 32 que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

34. Ligando de ácido nucleico o fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

35. Uso de un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en la fabricación de un fármaco para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.

36. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para su uso como agente de diagnóstico in vitro.

37. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para su uso como agente de diagnóstico in vivo.

38. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad.

39. Ligando, fármaco o uso según cualquiera de las reivindicaciones 34, 35 ó 38, en el que dicha enfermedad es la enfermedad de Alzheimer o un infarto de miocardio.