Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas.

Procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés,

en donde dicho método comprende

a) proporcionar una línea celular de empaquetamiento que está transfectada con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector que comprende un gen que codifica una molécula orientadora;

en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectiva y específicamente la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas); en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación a sulfato de heparano para disminuir o eliminar su capacidad de fijación al sulfato de heparano,

b) cultivar la línea celular de empaquetamiento; y

c) recuperar el virus recombinante de la línea celular de empaquetamiento.

Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas

Antecedentes de invención La invención se refiere de forma general a la introducción selectiva de genes, y más en particular, al uso de un virus 5 recombinante que comprende una molécula orientadora que se dirige selectivamente a las células dendríticas y se fija a ellas, y puede, por lo tanto, utilizarse para vacunación con células dendríticas.

La inmunización es una de las herramientas más productivas en la práctica médica moderna, pero permanece plagada de limitaciones. Algunas enfermedades infecciosas, tales como el VIH/sida, la malaria y la tuberculosis, siguen sin poderse controlar del todo mediante inmunización, mientras que otras enfermedades infecciosas están 10 controladas por pautas complejas de inmunización. El cáncer es una diana prometedora para los tratamientos inmunoterápicos, pero los resultados clínicos en los ensayos experimentales han sido desalentadores (Rosenberg, S.

A. et al, 2004, Nat. Med. 10: 909-915) . Se necesitan nuevos procedimientos de inmunización, por ejemplo, para inducir de forma fiable la inmunidad antitumoral.

Las células dendríticas (CD) desempeñan funciones críticas en la inmunidad innata y en la adaptativa. Las CD son células presentadoras de antígeno especializadas con la única capacidad de capturar y procesar los antígenos, migrar desde la periferia hacia un órgano linfático y presentar los antígenos a los linfocitos T en reposo de una manera restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (Banchereau, J. & Steinman, R. M. 1998. Nature 392: 245-252; Steinman, R. M. et al., 2003. Ann. Rev. Immunol. 21: 685-711) . Estas células proceden de la médula ósea (MO) y se caracterizan por la forma dendrítica y su gran movilidad. Las CD inmaduras son duchas en la ingestión de antígenos y se distribuyen a modo de centinelas por los tejidos periféricos de todo el cuerpo. Sin embargo, es necesario que las CD maduren para montar una respuesta inmunitaria eficaz (Steinman, R. M. et al. 2003. véase más arriba) . Las CD maduras expresan una gran cantidad del complejo CMH-antígeno y otras moléculas coestimuladoras (tales como CD40, B7-1, B7-2 y CD1a) (Steinman, R. M., 1991. Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296; Banchereau, J. y R. M. Steinman, 1998, véase más arriba) . Estas moléculas desempeñan funciones importantes a la hora de estimular los linfocitos T.

El descubrimiento de que las CD funcionan como células presentadoras de antígeno (CPA) especializadas ha impulsado la investigación sobre la inmunización/vacunación basada en las CD que implican cargar las CD con antígenos específicos (Banchereau, J. y Palucka, A. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, C. G. et al. 2004, Nat. Med. 10: 475-480) . Sin embargo, todos estos estudios implican hay que cargar ex vivo las CD con los antígenos específicos. A continuación, las CD generadas ex vivo se administran al paciente. La generación ex vivo de las CD para cada paciente es un procedimiento muy laborioso.

En comparación, la presente invención se refiere, entre otros, al reconocimiento selectivo, la carga de antígenos y la activación de las CD in vivo, lo que da lugar al tratamiento in vivo de enfermedades mediante la generación de una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. Así pues, la invención satisface una antigua necesidad de tratamientos eficaces y efectivos para la inmunización/vacunación.

Compendio de la invención La invención da a conocer un procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés, en donde dicho procedimiento comprende: a) dar a conocer una línea de células de empaquetamiento que se transfecta con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector 40 que comprende un gen que codifica una molécula orientadora; en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que se dirige específicamente a la la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas) , en donde el virus recombinante comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectivamente dicha célula que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación del sulfato de 45 heparano para disminuir o eliminar su fijación al sulfato de heparano, b) cultivar la línea de células de empaquetamiento; y c) recuperar el virus recombinante del cultivo de células de empaquetamiento.

El algunos aspectos de la invención, el vector retrovírico puede ser un vector lentivírico, opcionalmente un vector lentívirico que comprende las secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del VIH.

En algunos aspectos la glucoproteína E2 de alfavirus es una glucoproteína del virus de Sindbis. En algunos aspectos, el virus comprende una proteína E1 del Sindbis y una proteína E2 del Sindbis que actúa selectivamente de forma específica sobre la DC-SIGN.

La invención se define adicionalmente en las reivindicaciones que la acompañan.

En algunas realizaciones, la molécula orientadora es SINmu, también conocida como SVGmu (SEQ ID n.º 11) .

En algunas realizaciones, el polinucleótido a introducir a una célula dendrítica comprende al menos uno de lo siguiente: un gen que codifica una proteína de interés, un gen que codifica un siRNA, y un gen que codifica un microRNA. El gen que codifica una proteína de interés puede codificar un antígeno, tal como un antígeno tumoral o un antígeno del VIH.

El virus recombinante se puede producir mediante la transfección de una línea celular de empaquetamiento con un vector vírico que comprende el polinucleótido a introducir y un vector que comprende un gen que codifica la molécula orientadora; el cultivo de la línea celular de empaquetamiento; y la recuperación del virus recombinante a partir del cultivo de las células de empaquetamiento. En algunas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular 293.

El virus recombinante preparado mediante el presente procedimiento se puede utilizar para introducir un polinucleótido in vitro en una célula dendrítica, o in vivo en una célula dendrítica de un sujeto. El sujeto es típicamente un mamífero, tal como un humano, un ratón o un conejillo de Indias.

La descripción da a conocer un virus recombinante que comprende: un polinucleótido de interés; y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. La molécula orientadora se fija específicamente a la DC-SIGN. El virus recombinante puede comprender secuencias de un genoma de lentivirus, tales como secuencias de un genoma de VIH. En otras realizaciones, el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus, tales como secuencias de un genoma del virus de las células madre de ratón (VCMR) o un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) .

La molécula orientadora puede comprender una glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross y virus de Aura. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es una glucoproteína vírica procedente del virus de Sindbis. En realizaciones particulares, la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11) .

El polinucléotido puede ser, por ejemplo, al menos uno de lo siguiente: un gen que codifica una proteína de interés,

un gen que codifica un siRNA, y un gen que codifica un microRNA de interés. En algunas realizaciones, el polinucléotido codifica un antígeno, tal como un antígeno tumoral o un antígeno del VIH.

La descripción da a conocer procedimientos para estimular una respuesta inmunitaria de un mamífero. Un polinucleótido que codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria se introduce en las células dendríticas que expresan la DC-SIGN al poner en contacto las células dendríticas con un virus recombinante que comprende el polinucleótido y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es específica de la DC-SIGN y no se fija apreciativamente a otras moléculas. En otras realizaciones, la molécula orientadora se fija preferiblemente a la DC-SIGN.

La descripción da a conocer vectores que codifican moléculas orientadoras que se fijan a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es una glucoproteína vírica modificada. En otras realizaciones, la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11) . La molécula orientadora se fija específicamente a la DC-SIGN en algunas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés, en donde dicho método comprende a) proporcionar una línea celular de empaquetamiento que está transfectada con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector que comprende un gen que codifica una molécula orientadora;

en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectiva y específicamente la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas) ; en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación a sulfato de heparano para disminuir o eliminar su capacidad de fijación al sulfato de heparano,

b) cultivar la línea celular de empaquetamiento; y

c) recuperar el virus recombinante de la línea celular de empaquetamiento.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector retrovírico es un vector lentivírico.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector lentivírico comprende secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del VIH.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glucoproteína de alfavirus es una glucoproteína del virus de Sindbis.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el virus comprende una proteína E1 del Sindbis y una proteína E2 del Sindbis que reconocen selectiva y específicamente a la DC-SIGN.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen de interés codifica una proteína de interés.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proteína de interés es un antígeno.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno del VIH.