INMUNOGLOBULINAS DESPROVISTAS DE CADENAS LIGERAS.

Una región VH derivada de una inmunoglobulina de 4 cadenas, que contiene un sitio de señalización de antígeno o varios sitios de fijación de antígeno y en la cual los residuos de aminoácidos han sido reemplazados parcialmente por secuencias específicas o residuos de aminoácidos de una inmunoglobulina (denominada inmunoglobulina de cadena pesada) que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas capaces de reconocer y fijar uno o varios antígenos,

estando dicha inmunoglobulina de cadena pesada desprovista de cadenas ligeras y obteniéndose a partir de Camélidos y en la cual, en dicha VH derivada, la leucina, prolina o glutamina en la posición 45 de la región VH ha sido reemplazada por un residuo de aminoácido cargado o un residuo cisteína

Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.

La invención se refiere a nuevas inmunoglobulinas aisladas que están desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas no consisten en los productos de degradación de las inmunoglobulinas compuestas tanto de cadenas polipeptídicas pesadas como de cadenas polipeptídicas ligeras, sino que por el contrario, la invención define un nuevo miembro de la familia de las inmunoglobulinas, especialmente un nuevo tipo de moléculas capaces de estar implicadas en el reconocimiento inmune. Tales inmunoglobulinas pueden usarse para varios propósitos, especialmente para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, incluyendo la protección frente a los agentes patológicos o la regulación de la expresión o la actividad de las proteínas.

Hasta ahora, la estructura propuesta para las inmunoglobulinas consiste en un modelo de cuatro cadenas que se refiere a la presencia de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas (cadenas ligeras) y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas (cadenas pesadas) unidas mediante puentes disulfuro para formar macromoléculas con forma de Y o de T. Estas cadenas están compuestas por una región constante y una región variable, estando la región constante subdividida en varios dominios. Las dos cadenas polipeptídicas pesadas se unen normalmente mediante puentes disulfuro en una denominada "región bisagra" situada entre el primer y segundo dominios de la región constante.

Entre las proteínas que forman la clase de las inmunoglobulinas, la mayoría de ellas son anticuerpos y en consecuencia, presentan un sitio de unión al antígeno o varios sitios de unión al antígeno.

Según el modelo de cuatro cadenas, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo se localiza en los dominios variables de cada una de las cadenas pesada y ligera y requiere la asociación de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera.

Para la definición de estas inmunoglobulinas de modelo de cuatro cadenas, se hace referencia a Roitt. 1 et al. (Immunology-second-Edition Gower Medical Publishing USA, 1989). La referencia se hace especialmente a la parte concerniente a la definición de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, a sus estructuras polipeptídicas y genéticas, a la definición de sus regiones variables y constantes y a la obtención de los fragmentos producidos por la degradación enzimática según técnicas bien conocidas.

Los inventores han establecido sorprendentemente que pueden aislarse moléculas diferentes a partir de animales que las producen naturalmente, moléculas que tienen propiedades funcionales de inmunoglobulinas, estando esas funciones relacionadas en algunos casos con elementos estructurales que son distintos de los implicados en la función de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas debido, por ejemplo, a la ausencia de cadenas ligeras.

La invención se refiere a inmunoglobulinas del modelo de dos cadenas que no corresponden ni con los fragmentos obtenidos por ejemplo mediante la degradación, en particular la degradación enzimática, de una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas, ni corresponde con la expresión en las células huésped del ADN que codifica para la región constante o la variable de una inmunoglobulina natural del modelo de cuatro cadenas o con una parte de estas regiones, ni corresponde con los anticuerpos producidos en las linfopatías, por ejemplo, en ratones, ratones, ratas o humanos.

E.S. Ward et al. (1) ha descrito algunos experimentos realizados en los dominios variables de las cadenas polipeptídicas pesadas (V_H) o/y en las cadenas polipeptídicas ligeras (V_K/F_v) para probar la capacidad de estos dominios variables para unir antígenos específicos. Para este propósito, se preparó una librería de genes V_H a partir del ADN genómico del bazo del ratón inmunizado previamente con estos antígenos específicos.

Ward et al han descrito en su publicación que los dominios V_H son relativamente adhesivos, presumiblemente debido a la superficie hidrófoba expuesta, normalmente tapada por los dominios V_K o V_?. Por consiguiente, ellos se imaginaron que debería ser posible diseñar dominios V_H que tuvieran propiedades mejoradas y además, que los dominios V_H con actividades de unión pudieran servir como los componentes básicos para fabricar fragmentos variables (fragmentos F_V,) o anticuerpos completos.

La publicación de Blier P.R. et al (The Journal of Immunology, vol. 139, 3996-4006, nº 12, 15 de diciembre de 1987) describe secuencias de nucleótidos incompletas obtenidas a partir de hibridomas.

La invención no parte de la idea de que los diferentes fragmentos (cadenas ligeras y pesadas) y los diferentes dominios de estos fragmentos de la inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas pueda modificarse para definir sitios de unión al antígeno nuevos o mejorados o una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas.

Los inventores han determinado que las inmunoglobulinas pueden tener una estructura diferente al modelo conocido de cuatro cadenas y que tales inmunoglobulinas diferentes ofrecen nuevos medios para la preparación de reactivas de diagnóstico, agentes terapéuticos o cualquier otro reactivo para su uso en investigación o para propósitos industriales.

Por tanto, la solicitud proporciona nuevas inmunoglobulinas que son capaces de mostrar propiedades funcionales de las inmunoglobulinas del modelo de cuatro cadenas, aunque su estructura parezca ser más apropiada en muchas circunstancias para su uso, su preparación y en algunos casos, para su modificación. Además, estas moléculas pueden considerarse como estructuras principales para la modificación de otras inmunoglobulinas. Las ventajas proporcionadas por estas inmunoglobulinas comprenden la posibilidad de prepararlas con una mayor facilidad.

Las inmunoglobulinas preparados de acuerdo con la invención están caracterizadas porque comprenden dos cadenas polipeptídicas pesadas suficientes para la formación de un sitio completo de unión al antígeno o de varios sitios de unión al antígeno, estando además estas inmunoglobulinas desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas se caracterizan además por el hecho de que son el producto de la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica, de un ADN o de un ADNc que tiene la secuencia de una inmunoglobulina desprovista de cadenas ligeras, obtenible a partir de linfocitos o de otras células de camélidos.

Las inmunoglobulinas descritas pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de las secuencias que se describen en la figura 7.

Las inmunoglobulinas preparadas de acuerdo con la invención, que están desprovistas de cadenas ligeras, están de manera que los dominios variables de sus cadenas pesadas tengan propiedades que difieren de las de los V_H de la inmunoglobulina de cuatro cadenas. El dominio variable de una inmunoglobulina de cadena pesada de la invención no tiene sitios de interacción normales con el dominio V_I, ni con el C_H1 que no existe en las inmunoglobulinas de cadena pesada. Por lo tanto, es un fragmento novedoso en muchas de sus propiedades, tal como la solubilidad y la posición del sitio de unión. Por razones de claridad, lo llamaremos V_HH en este texto para distinguirlo de los V_H clásicos de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas.

Por "un sitio de unión al antígeno completo" se quiere decir, de acuerdo con la invención, un sitio que permitirá por sí solo el reconocimiento y la unión completa de un antígeno. Esto podría verificarse mediante cualquier método conocido con respecto a los ensayos de la afinidad de la unión.

Estas inmunoglobulinas que pueden ser preparadas mediante la técnica de ADN recombinante, o aisladas de animales, algunas veces serán denominadas "inmunoglobulinas de cadenas pesadas" en las siguientes páginas. Preferiblemente estas inmunoglobulinas están en una forma pura.

La solicitud describe inmunoglobulinas que son obtenidas en células procarióticas, especialmente en células de E. coli por un proceso que comprende los pasos de:

1. Una región V_H derivada de una inmunoglobulina de 4 cadenas, que contiene un sitio de señalización de antígeno o varios sitios de fijación de antígeno y en la cual los residuos de aminoácidos han sido reemplazados parcialmente por secuencias específicas o residuos de aminoácidos de una inmunoglobulina (denominada inmunoglobulina de cadena pesada) que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas capaces de reconocer y fijar uno o varios antígenos, estando dicha inmunoglobulina de cadena pesada desprovista de cadenas ligeras y obteniéndose a partir de Camélidos y en la cual, en dicha V_H derivada, la leucina, prolina o glutamina en la posición 45 de la región V_H ha sido reemplazada por un residuo de aminoácido cargado o un residuo cisteína.

2. Una región V_H derivada de una inmunoglobulina de 4 cadenas, en donde los residuos de aminoácidos han sido reemplazados parcialmente por secuencias específicas o residuos de aminoácidos de una inmunoglobulina (denominada inmunoglobulina de cadena pesada) que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas capaces de reconocer y fijar uno o varios antígenos, estando dicha inmunoglobulina de cadena pesada desprovista de cadenas ligeras y obteniéndose a partir de Camélidos, y en la cual, en dicha V_H derivada, la leucina, prolina o glutamina en la posición 45 de la región V_H ha sido reemplazada por un residuo de aminoácido cargado o un residuo cisteína y que tiene mayor solubilidad.

3. La región V_H de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la leucina, prolina o glutamina en la posición 45 de la región V_H ha sido reemplazada por un residuo arginina, ácido glutámico o cisteína.

4. Una región V_H de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde dicha V_H contiene en sí misma un sitio de fijación de antígeno o varios sitios de fijación de antígeno y funciona en ausencia de V_L.

5. Una región V_H de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde una mayor solubilidad de dicha V_H se consigue hasta una concentración superior a 0,5 mg/ml, preferiblemente por encima de 1 mg/ml y más ventajosamente por encima de 2 mg/ml.

6. La región V_H de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se establece un enlace disulfuro dentro de la región variable, que implica residuos de aminoácidos en la región CDR3.

7. La región V_H de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la cual los bucles CDR de la región están enlazados a otras partes de la región V_H por la introducción de cisteínas apareadas, en particular en las cuales el bucle CDR₃ está enlazado al FR₂ o CDR₁ y más especialmente donde la cisteína del CDR₃ de la V_H está enlazada a una cisteína en la posición 31 ó 33 de CDR₁ o en la posición 45 de FR₂.

8. La región V_H de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los bucles CDR están enlazados a otras partes de una región V por introducción de cisteínas apareadas.

9. Un proceso para la preparación de una inmunoglobulina de cadena pesada que está desprovista de cadenas ligeras y del primer dominio (CH1) de la región constante de sus cadenas polipeptídicas pesadas o un fragmento de la misma, seleccionándose dicho fragmento de un fragmento correspondiente a una cadena polipeptídica pesada, fragmentos obtenidos por digestión enzimática, especialmente los obtenidos por digestión parcial con papaína que conducen al fragmento Fc, conduciendo al fragmento FV_HHh o su dímero F(V_HHh)2, o un fragmento obtenido por digestión ulterior con papaína del fragmento Fc, conduciendo al fragmento pFc, fragmentos homólogos obtenidos con otras enzimas proteolíticas, un fragmento de al menos 20 aminoácidos de la región variable de la inmunoglobulina, o el dominio variable completo, especialmente un fragmento correspondiente a los dominios aislados V_HH o a los dímeros V_HH enlazados al disulfuro bisagra, o un fragmento correspondiente a al menos 10, preferiblemente 20 aminoácidos de la re- gión constante o a la región constante completa de la inmunoglobulina, comprendiendo dicho proceso los pasos de:

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende adicionalmente el paso de preparar fragmentos de las inmunoglobulinas seleccionadas.

11. Un proceso para la preparación de la región V_H de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende los pasos de:

12. Un proceso para la preparación de la región V_H de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las secuencias o residuos de aminoácidos específicos de una inmunoglobulina (denominada inmunoglobulina de cadena pesada) que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas capaces de reconocer y fijar uno o varios antígenos, estando dicha inmunoglobulina de cadena pesada desprovista de cadenas ligeras, se insertan en dicha región V_H (sic) son fragmentos peptídicos de la región de la inmunoglobulina de cadena pesada V_HH.