Inmunoglobulina citotóxica.

Anticuerpo modular citotóxico, que se une específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de kd

Inmunoglobulina citotóxica La invención se refiere a una inmunoglobulina citotóxica.

Los anticuerpos monoclonales se han usado ampliamente como agentes de unión terapéuticos. La estructura básica de los anticuerpos se explicará en el presente documento usando como ejemplo una inmunoglobulina IgG 1 intacta.

Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula de anticuerpo con forma de Y. Cada una de las cadenas pesadas tiene cuatro dominios. Los dominios variables (VH) en el extremo amino son las puntas de la Y. A estos les siguen tres dominios constantes: CH1, CH2, y el CH3 en el extremo carboxi, y la base del tallo de la Y. Un tira corta, la zona de intercambio, conecta las regiones constantes y variables de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab) . Un Fc y dos fragmentos Fab idénticos se pueden producir mediante escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, el variable (VL) y el constante (CL) , separados por una zona de intercambio.

Los puentes disulfuro en la región bisagra conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante puentes disulfuro adicionales. Los restos de hidratos de carbono unidos por Asn están unidos en diferentes posiciones en los dominios constantes en función de la clase de inmunoglobulina. Para la IgG 1, dos puentes disulfuro en la región bisagra, entre los pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante dos puentes disulfuro adicionales, entre las Cys229 en los dominios CH1 y las Cys214 en los dominios CL. Los restos de hidratos de carbono están unidos a la Asn306 de cada CH2, de modo que se genera un saliente pronunciado en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras (VH) y (VL) residen en las "puntas" de la Y, en las que están colocadas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lateral sobre el cual se localiza el extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta de un modo para mediar con eficacia en las funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con los receptores Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con las proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos se localiza en el lado opuesto de la punta, que puede denominarse "parte inferior " de la Y.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (X) y kappa (k) . are found in antibodies. Una inmunoglobulina dada tiene cadenas k o cadenas X, nunca una de cada. No se han hallado diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas X o k.

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta empaquetadas fuertemente una contra otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina el pliegue de la inmunoglobulina. El pliegue de la inmunoglobulina de los dominios constantes contiene una lámina de 3 hebras empaquetada contra una lámina de 4 hebras. El pliegue se estabiliza con puentes de hidrógeno entre las hebras beta de cada lámina, mediante enlaces hidrofóbicos entre los residuos de las láminas opuestas en el interior y mediante un puente disulfuro entre las láminas. La lámina de 3 hebras comprende hebras C, F y G, y la lámina de 4 hebras tiene hebras A B, E, y D. Las letras A a la G indican las posiciones secuenciales de las hebras beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de inmunoglobulina.

El pliegue de los dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 hebras. La lámina de 5 hebras es estructuralmente homóloga a la lámina de 3 hebras de los dominios constantes, pero contiene las hebras adicionales C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F G) tienen la misma topología y una estructura similar a la de sus homólogos en los pliegues de inmunoglobulina del dominio constante. Un puente disulfuro une las hebras B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes.

Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las hebras beta B-C, C'-C", Y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los residuos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, de modo que se confiere especificidad a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH en las puntas de las moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) colaboran en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica de antígeno. Por tanto, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las hebras B-C. C'-C", y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las hebras B-C C'-C", y F-G del dominio variable de la cadena pesada.

Los bucles que no son bucles de CDT en una inmunoglobulina nativa o que no forman parte de la cavidad de unión a antígeno determinada por los bucles de CDR y, opcionalmente, bucles adyacentes dentro de la región del bucle de la CDR, no tienen especificidad de unión a antígeno o de unión a epítopo, pero contribuyen al correcto plegamiento de la totalidad de la molécula de inmunoglobulina y/o su función efectora o de otro tipo y, por tanto, se denominan bucles estructurales para los fines de la presente invención.

Documentos de la técnica anterior muestran que hasta ahora se ha usado el armazón de tipo inmunoglobulina con el fin de manipular el sitio de unión a antígeno existente, de modo que se introducen nuevas propiedades de unión. En la mayoría de los casos, las regiones CDR se han modificado mediante ingeniería para la unión al antígeno, en otras palabras, en el caso del pliegue de inmunoglobulina. solo el sitio de unión a antígeno natural se ha modificado con el fin de cambiar la afinidad o especificidad de unión. Existe una gran cantidad de bibliografía que describe diferentes formatos dichas inmunoglobulinas manipuladas, con frecuencia expresadas en forma de fragmentos Fc monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab, bien expresados sobre la superficie de partículas de fagos o expresados de forma soluble en varios sistemas de expresión procariotas o eucariotas.

El documento W006/072620A1 describe un procedimiento de modificación por ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región bucle estructural para obtener nuevos sitios de unión a antígeno. Este procedimiento es ampliamente aplicable a las inmunoglobulinas y se puede usar para producir una bibliotecas de inmunoglobulinas dirigidas a diversos antígenos. Se ha demostrado que una biblioteca de CH3 es útil para seleccionar ligantes específicos de un antígeno.

El documento WO08/003103A2 la adsorción de una biblioteca de CH3, CH1 o CL en un péptido sintético, que representa un mimotopo del antígeno CD20.

En la técnica se han propuesto varias bibliotecas de inmunoglobulina para obtener ligantes específicos de inmunoglobulinas. La técnica anterior hace referencia a la expresión monovalente monomérica de dominios de unión, por lo general, el documento WO9209690A2 describe partículas de fagemido que muestran una única copia de una proteína de fusión sobre la superficie de la partícula. De este modo, se describió la obtención de ligantes de alta afinidad a partir de una biblioteca de partículas de fagemido, también denominados bacteriófagos. Se proporcionan vectores de expresión replicable que comprenden genes que codifican un polipéptido de unión y una proteína de la cubierta del fago, para formar una fusión génica que codifica una proteína de fusión, que es una proteína quimérica de una partícula de fagemido, la proteína de la cubierta del fago y el polipéptido de unión.

El documento US5223409 describe en general el procedimiento de fusión de un gen que codifica una proteína de interés al dominio en el extremo N de la proteína de la cubierta III génica del fago filamentoso M13. La fusión génica se muta para formar una biblioteca de proteínas de fusión relacionadas estructuralmente que se expresan en cantidad baja sobre la superficie de una partícula de fagemido. Se usa selección y detección selectiva biológicas para identificar ligandos nuevos útiles... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo modular citotóxico, que se une específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de kd<10-8 M, que es un Fc de unión a antígeno (Fcab) de una molécula de anticuerpo con función efectora, que es al menos una actividad de ADCC, ADCP y CDC con un sitio de unión a antígeno modificado en la región bucle de un dominio CH3 para unirse a dicha diana de la superficie celular, en donde la diana de la superficie celular es un receptor de la clase erbB.

Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene actividad ADCC. 10

3. Anticuerpo modular de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho sitio de unión a antígeno comprende una secuencia de anticuerpo aleatorizada.

4. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sitio de unión a

antígeno se localiza en el intervalo de los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117, en donde la numeración es conforme al esquema de numeración de IMGT.

5. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un Fc de IgG1. 20

6. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha diana se selecciona del grupo que consiste en EGFR Her2, Her2neu, HER3 y HER4.

7. Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho sitio de unión a antígeno se une

específicamente a Her2 y contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los números de SEC ID como se indican en las Tablas 4 y 5, contenido en un bucle EF y/o AB y/o CD.

8. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se puede obtener de una biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a un ligando efector. 30

9. Molécula de combinación que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con otros péptidos o polipéptidos.

10. Anticuerpo modular de combinación que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 8, que además está combinado con uno o más anticuerpos modulares modificados o con anticuerpos modulares no modificados o partes de los mismos.

11. Anticuerpo modular de combinación de acuerdo con la reivindicación 10, que es una molécula de anticuerpo completa. 40

12. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, 13. Método de producción de un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que 45 comprende las etapas de:

a. proporcionar una biblioteca de Fcab

b. poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando efector,

c. seleccionar un miembro de la biblioteca que tenga ambas propiedades, 50

(i) afinidad por la unión a la diana de kd<10-8 M o CI50<10-8 M, y

(ii) actividad ADCC, ADCP y CDC, y

d. fabricar una preparación del anticuerpo modular, 55

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la biblioteca contiene miembros que tienen una secuencia de anticuerpo aleatorizada.

15. Método de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, que además comprende la etapa de maduración de la afinidad 60 de dicho miembro de la biblioteca.

16. Anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para usar en el tratamiento de un paciente que sufra un tumor sólido, en donde el tumor expresa un receptor de la clase erbB, 44