Composiciones inmunogénicas para PCV2 y métodos de producir composiciones de este tipo.

Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante,

en el que dicho método incluye las etapas de:

(i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectura abierto 2;

(ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y

(iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante,

en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus.

Composiciones inmunogénicas para PCV2 y métodos de producir composiciones de este tipo.

LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato papel y en formato legible por ordenador.

Un aspecto de la presente divulgación se relaciona con la recuperación de una proteína expresada por el marco de 5 lectura abierto 2 (ORF2) del circovirus porcino tipo 2 (PCV2) . Más particularmente, la proteína es una proteína re-combinante expresada por un virus transfectado que contiene secuencias de codificación recombinantes del circovi-rus porcino tipo 2, el marco de lectura abierto 2. Aún más particularmente, se deja que el virus transfectado infecte células en un medio de crecimiento y la proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 se recupera en el so-brenadante, y no del interior de las células. Más particularmente aún, el método comprende los pasos de amplificar 10 el gen del marco de lectura abierto 2 del circovirus porcino tipo 2, clonar esta porción amplificada en un primer vec-tor, recortar la porción del marco de lectura abierto 2 de este primer vector y clonarla en un vector de transferencia, cotransfectar el vector de transferencia con un vector viral en células en un medio de crecimiento, lograr la infección de las células por el vector viral y de esa manera expresar el marco de lectura abierto 2 y recuperar la proteína re-combinante expresada codificada por el marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante. 15

En otro aspecto, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunogénica eficaz para inducir una respuesta inmune contra PCV2 y con métodos para producir dicha composiciones inmunogénicas. Más particular-mente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica eficaz para proveer una respuesta inmune que proteja a un animal que recibe la composición y reducir, o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con una infección por PCV2. Aún más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una com-20 posición inmunológica basada en proteínas que confiera una protección eficaz contra una infección por PCV2. Aún más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica que comprende el ORF2 de PCV2, en donde la administración de PCV2-ORF2 da como resultado la protección contra una infección por PCV2. Más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica eficaz para conferir una inmunidad eficaz a porcinos que reciban la composición inmunológica y donde la composición com-25 prende la proteína expresada por el ORF2 de PCV2.

Divulgación de la Técnica Anterior El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus a ADN pequeño (17-22 nm de diámetro) , icosahédrico, desnudo o sin envoltura, que contiene un genoma circular de cadena simple. Kim et al (J. Vet. Sci, 2002, 3 (1) : 19-23) caracterizan las proteínas recombinantes de aislado de campo de PCV2. Nawagitgul et al (J. Gen. Virol, 2000, 81: 2281-2287) in-30 forman que una proteína estructural principal de PCV2 es codificada por ORF2. El PCV2 comparte un 80% de iden-tidad de secuencia aproximadamente con el circovirus porcino de tipo 1 (PCV1) . Sin embargo, a diferencia del PCV1, que en general no es virulento, los porcinos infectados con PCV2 presentan un síndrome conocido común-mente como síndrome de desmedro multisistémico post-destete (PMWS) . El PMWS se caracteriza clínicamente por desmedro o debilidad, palidez de la piel, letargia, dificultad respiratoria, diarrea, ictericia e ictericia ligera. En algunos 35 cerdos afectados, se evidencia una combinación de todos los síntomas, en tanto otros cerdos solamente presentan uno o dos de estos síntomas. Durante la necropsia, también lesiones microscópicas y macroscópicas en diversos te-jidos y órganos, siendo los órganos linfoides el sitio más común de las lesiones. Se ha observado una fuerte correla-ción entre la cantidad de antígeno o ácido nucleico PCV2 y la gravedad de las lesiones linfoides microscópicas. Los índices de mortalidad en los cerdos infectados con PCV2 pueden acercarse a tanto como un 80%. Además del 40 PMWS, el PCV2 se ha asociado con otras diversas infecciones incluyendo seudorrabia, síndrome reproductor y res-piratorio de porcinos (PRRS) , enfermedad de Glasser, meningitis estreptocócica, salmonelosis, colibacilosis de post-destete, hepatosis dietética y bronconeumonía supurante.

En el pasado, se ha utilizado la proteína del marco de lectura abierto 2 (ORF2) del PCV2, con un peso molecular aproximado de 30 kDa cuando se corre sobre un gel SDS-PAGE, como un componente antigénico en vacunas para 45 PCV2. Blanchard et al (Vaccine 21, 2003, 4565-4575) describen protocolos de de vacunación basados en ADN de 2 inyecciones de refuerzo utilizando un cultivo de 72 h en la producción de un lisado de proteína bruto. Los métodos típicos para obtener el ORF2 para su uso en dichas vacunas comprende en general amplificar el ADN que codifica el ORF2 del PCV2, transfectar un vector viral con el ADN del ORF2, infectar células con dicho vector viral que contiene el ADN del ORF2, permitir que el virus exprese la proteína ORF2 dentro de la célula y extraer la proteína ORF2 de la 50 célula mediante lisis celular. Estos procedimientos generalmente demoran hasta cuatro días después de la infección de las células por el vector viral. Sin embargo, estos procedimientos tienen la desventaja que los procedimientos de extracción son costosos y también demoran mucho tiempo. Además, no se recupera una gran cantidad de ORF2 de las células; en consecuencia, es necesario infectar una gran cantidad de células con una gran cantidad de vectores virales con el fin de obtener cantidades suficientes de la proteína expresada recombinante para su uso en vacunas y 55

semejantes.

Los enfoques actuales sobre inmunización contra PCV2 incluyen vacunas basadas en ADN, tales como las que se describen en la Patente de EEUU Nº 6.703.023. Sin embargo, dichas vacunas han resultado ineficaces para conferir una inmunidad protectora contra una infección por PCV2 y los signos clínicos asociados con la misma.

Por consiguiente, persiste en la técnica la necesidad de un método para obtener una proteína ORF2, que no requie-5 ra extracción de la proteína ORF2 desde el interior de las células infectadas. También se necesitan métodos de ob-tención de la proteína ORF2 recombinante en cantidades suficientes como para preparar eficazmente composicio-nes de vacunas. Se necesitan asimismo métodos para obtener la proteína ORF2 que no comprendan los complica-dos y trabajosos métodos requeridos por los protocolos actuales de extracción de la proteína ORF2. Finalmente, con respecto a las composiciones, en la técnica se necesita una composición inmunogénica que confiera una inmunidad 10 protectora contra una infección por PCV2 y que disminuya la severidad o permita prevenir los signos clínicos asocia-dos con la misma.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención supera los problemas inherentes de la técnica anterior y provee un avance distintivo en el es-tado de la técnica. 15

La presente invención proporciona:

[1] Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante, en el que dicho método incluye las etapas de:

(i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectu-ra abierto 2; 20

(ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y (iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante, en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus.

[2] El método de [1], que comprende las etapas de 25

A) clonar dicho marco de lectura abierto 2 recombinante de PCV2 en un vector de transferencia;

B) introducir la parte de dicho vector de transferencia que contiene dicho marco de lectura abierto 2 recombi-nante en un baculovirus;

C) infectar células en medios con dicho baculovirus;

D) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 de dicho marco de lectura 30 abierto 2;

E) separar del sobrenadante células que contienen dicho vector de baculovirus; y F) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en dicho sobrenadante al menos cinco días después de infectar las células con dicho baculovirus.

[3] El método de [1] o [2], en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante expresada es se-35 cretada por las células en el medio de crecimiento circundante, y en el... [Seguir leyendo]

1. Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante, en el que dicho método incluye las etapas de:

(i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectu-5 ra abierto 2;

(ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y (iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante, en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus. 10

2. El método de la reivindicación1, que comprende las etapas de

A) clonar dicho marco de lectura abierto 2 recombinante de PCV2 en un vector de transferencia;

B) introducir la parte de dicho vector de transferencia que contiene dicho marco de lectura abierto 2 recombi-nante en un baculovirus;

C) infectar células en medios con dicho baculovirus; 15

D) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 de dicho marco de lectura abierto 2;

E) separar del sobrenadante células que contienen dicho vector de baculovirus; y F) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en dicho sobrenadante al menos cinco días después de infectar las células con dicho baculovirus. 20

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante ex-presada es secretada por las células en el medio de crecimiento circundante, y en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante más que del interior de las células.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho método incluye, además, la etapa de amplificar dicho marco de lectura abierto 2 de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lectura abierto 25 en dicho vector de transferencia.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho marco de lectura abierto 2 com-prende, además, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia 5 de Kozak, un sitio 3 Eco-RI y combinaciones de los mismos.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia 5 de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1. 30

7. El método de la reivindicación 5, en el que dicho sitio 3 EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho marco de lectura abierto de PCV2 comprende la SEQ ID NO: 4.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha proteína de marco de lectura abierto 2 comprende la SEQ ID NO: 6. 35

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos medios comprenden medios de células de insecto libres de suero.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, que comprende, además, las etapas de:

i) antes de la etapa A, clonar dicho marco de lectura abierto 2 amplificado en un primer vector;

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y 40

iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en la etapa A.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas células comprenden células SF+.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa de recuperación comprende la separación de desecho de células de la proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en medios a través de 45 una etapa de separación, en donde la etapa de separación incluye preferiblemente filtración.

14. Un método de preparar una composición para invocar una respuesta inmune contra PCV2, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) introducir una construcción en un baculovirus, comprendiendo dicha construcción ADN recombi-

nante de un marco de lectura abierto 2 de PCV2;

ii) infectar células con dicho baculovirus, estando dichas células en un medio de crecimiento;

iii) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante a partir de dicho marco de lectura abierto 2;

iv) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en el sobrenadante, en donde 5 dicha proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera al menos 5 días después de infectar dichas células con dicho baculovirus; y v) combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recuperada en el sobrenadante con un ad-yuvante adecuado u otro soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. El método de la reivindicación14, en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante se se-10 creta por las células en el medio de crecimiento circundante, y en donde la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante más que del interior de las células.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que dicho método incluye, además, la etapa de obtener de un vector de transferencia dicha construcción.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que dicho método incluye, además, la eta-15 pa de amplificar dicho marco de lectura abierto 2 a partir de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lec-tura abierto 2 en dicho vector de transferencia.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicho marco de lectura abierto 2 re-combinante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una una secuencia 5 de Kozak, un sitio 3 EcoRI y combinaciones de los mismos. 20

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha secuencia 5 de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1.

20. El método de la reivindicación 18, en el que dicho sitio 3 EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, comprendiendo dicho marco de lectura abierto 2 de PCV2 la SEQ ID NO: 4.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, comprendiendo dicha proteína de marco de 25 lectura abierto 2 la SEQ ID NO: 6.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que dichos medios comprenden medios de células de insecto libres de suero.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, que comprende, además, las etapas de:

i) clonar dicho marco de lectura abierto 2 en un primer vector; 30

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en dicho vector de

transferencia.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que dichas células comprende células SF+. 35

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, en el que dicha etapa de recuperación com-prende, además, la etapa de separar dichos medios de dichas células y desechos de células.

27. El método de la reivindicación 26, en el que dicha etapa de separación incluye la etapa de filtrar dichas cé-lulas, desechos de células y medio de crecimiento a través de un filtro que tiene poros que oscilan en tamaño de aproximadamente 0, 45 µm a aproximadamente 1, 0 µm. 40

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 27, en el que dicho método incluye, además, la etapa de inactivar dicho baculovirus añadiendo etilenimina binaria (BEI) ciclada y, después de haberse completado la inactivación, se añade una disolución de tiosulfato de sodio, antes de combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 con un adyuvante adecuado.

29. Una composiciòn de materia, obtenible por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-28. 45

30. El uso de la composición de la reivindicación 29 para la preparación de un medicamento para la prevención de una infección por PCV2.

31. Composición de la reivindicación 29 para uso como un medicamento.

32. Composición de la reivindicación 29 para uso como una vacuna para la prevención de una infección por PCV2.

33. Composición de la reivindicación 29 para uso en un método de prevenir una infección por PCV2.

34. Un método para producir un kit de diagnóstico para la detección de una infección por PCV2 en una muestra, 5 que comprende i) producir una proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante según se recoge en una cualquiera de las reivindicaciones 1-28;

ii) y envasar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante en un recipiente adecuado.

35. El método de la reivindicación 34, que comprende, además, la etapa de incluir un manual de instrucciones 10 con el recipiente que incluya la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante.

36. Kit que incluye al menos un recipiente que comprende al menos una dosis de la composición de la reivindicación 29, en donde dicha composición es inmunogénica y una dosis comprende al menos 2 µg de proteína de mar-co de lectura abierto 2 de PCV2.

37. Kit que comprende i) un recipiente que contiene al menos una dosis de la composición de la reivindicación 15 29 y ii) un recipiente que contiene una composición inmunogénica que comprende antígeno de PRRS.

38. Kit de la reivindicación 37, en donde el antígeno de PRRS es IngelVac PRRS MLV.