Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento.

Un kit para detectar un analito de ácido no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento,

que comprende:

(i) un primer contenedor que contiene un anticuerpo de captura unido a un soporte solido con un puente de ácido nucleico que consta de dos hebras de acido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de las cuales esta unida a un soporte sólido;

(ii) un segundo contenedor que tiene un conjugado del mismo anticuerpo o de un anticuerpo diferente y una molecula de marcador de acido nucleico; y

(iii) un tercer contenedor que contiene un ácido nucleico desplazador que tiene una secuencia por lo menos parcialmente complementaria a una de las hebras del puente de acido nucleico.

AlVIBITO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a kits para generar una serial en respuesta a un analito presente en una muestra. Especificamente, la invencion se refiere a kits que emplean deteccion por amplificacion de serial de un marcador de acido nucleico. Esta invencion tambien se refiere a kits para etiquetar anticuerpos u otras proteinas con ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Existe un inmuno ensayo tipico conocido como Ensayo Inmunoenzimatico Enlazado a Enzimas (ELISA) . El antigen° que va a ser detectado se elimina de la solucion mediante una adsorcion no especifica a una superficie solida, como por ejemplo el interior de un pocillo de placa de microtitulacion. Despues de lavar para eliminar el exceso de antigen° y bloquear los puntos restantes de la placa, el antigen° inmovilizado es contactado con un anticuerpo primario para formar un complejo inmune en el soporte solid°. El exceso de anticuerpo puede extraerse lavando la placa. El anticuerpo primario se detecta a traves de una enzima, que puede conjugarse directamente al anticuerpo primario (ELISA directo) o a un segundo anti-anticuerpo, que posteriormente se pone en contacto con la placa (ELISA indirecto) . La actividad enzimatica asociada con la superficie solida es proporcional a la cantidad de antigen° unido presente y puede medirse, por ejemplo utilizando un sustrato cromogenico para la enzima.

El Inmuno-PCR es similar al ELISA indirecto, pero utiliza una secuencia de ADN en lugar de una enzima como molecula de detección (ver, por ejemplo, Sano et al., Science, 1992, 258 : 120-22) . Sano etal., demostraron la eficacia de este metodo con un antigen° de albumina de suero bovino (BSA) y un anticuerpo primario anti

BSA. El ADN plasmido biotinilado se acoplo con el anticuerpo primario via la proteina A-avidina. La amplificacion del ADN asociado al antigeno por medio de 30 ciclos de reacciOn en cadena de polimerasa (PCR) permiti6 la detestaciOn mediante tintura con bromuro de etidio seguida de electroforesis de gel. Los autores informaron de una mejora en la sensibilidad de deteccion de aproximadamente cinco ordenes de magnitud en comparacion con la detección de ELISA. En teoria, una etiqueta de ADN puede detectarse con una sensibilidad extraordinaria (potencialmente hasta una copia sencilla) cuando es amplificada mediante PCR o mediante cualquier otra tecnica de amplificacion de acido nucleico exponencial. Sin embargo, la adicion secuencial de cada componente del ensayo requiere un lavado extensivo con el fin de reducir el material unido no especificamente.

El Inmuno-PCR tambien puede realizarse en un formato de inmunoensayo en sandwich. Un inmunoensayo en sandwich tipico utiliza dos anticuerpos que reconocen el antigen° que va a ser detectado. Se utiliza un anticuerpo de "captura" para revestir la superficie de un soporte solid°, como por ejemplo un pocillo, una gota o una particula de microtitulo. Se etiqueta un anticuerpo "informador" con una molecula de detección, como por ejemplo un is6topo radioactivo, un fluoroforo o una enzima. En algunos casos, puede utilizarse el mismo anticuerpo tanto para la captura como para el informe. Habitualmente, el antigen° entra en contact° en primer lugar con el anticuerpo informador en solucion o con el anticuerpo de captura en el soporte solid°, seguido de la adicion del anticuerpo restante. El complejo inmune especifico resultante se une a la superficie del soporte solid° y consiste en el antigeno combinado con dos anticuerpos. El antigeno y los anticuerpos sobrantes son eliminados lavando de forma repetida el soporte. Es de gran importancia mantener la integridad del complejo inmune inmovilizado durante la fase de lavado con el fin de maximizar la intensidad de la serial,

a la vez que se mejora la eliminacion del anticuerpo informador no unido, minimizando

de esta manera el fondo. Despues de los lavados, el anticuerpo informador unido es medido a troves de la molecula de detecciOn, como indicacion de la cantidad de antigeno presente.

El anticuerpo informador puede ser etiquetado directamente mediante una modificacion covalente del anticuerpo, o indirectamente a traves del enlace de un segundo anticuerpo o proteina que posea una etiqueta detectable. La adhesion indirecta puede conseguirse, por ejemplo, etiquetando el anticuerpo informado con biotina y adhiriendo la molecula de deteccion a la avidina. Cuando el sistema de deteccion es lo suficientemente sensible, el limite inferior del ensayo quedara determinado normalmente por el grado de fondo producido por el enlace no especifico del anticuerpo informador no unido.

Tambien se han indicado ejemplos de inmuno-PCR sandwich en la literatura (ver, por ejemplo, Joerger et al., Clin Chem, 1995, 41: 1371-77; Hendrickson et al., Nucleic Acids Res, 1995, 23: 522-529) . Los limites de deteccion para el formato de ensayo de Inmuno-PCR exceden los de los inmunoensayos de enzimas convencionales. Sin embargo, es necesario realizar una limpieza astringente, utilizando por ejemplo una solucion detergente, para eliminar los anticuerpos informadores con etiqueta ADN no especificamente unidos.

EP 1 249 500 se refiere a un metodo para la deteccion de un analito, en que un soporte solid° 5 se acopla con una primera secuencia de acido nucleico y una segunda secuencia complementaria se acopla a un anticuerpo por medio de una interaccion de biotina—avidina utilizando una secuencia de acid° nucleico biotinilado y un anticuerpo adherido a la avidina. Tambien explica la union de un acido nucleico

marcador detectable por PCR a un segundo anticuerpo de analito especifico por medio

de interacciones de biotina—avidina.

El formato de sandwich del Inmuno-PCR tambien ha sido utilizado para demostrar la detección de mUltiples antigenos ("multiplexing") (ver, por ejemplo, U.S. Pat. No. 5, 985, 548) . Las etiquetas de ADN de diferente longitud fueron adheridas cada una de ellas con anticuerpos informadores que reconocen diferentes antigenos que utilizan un ester de 5' N-hidroxisuccinimida (NHS) . Los conjugados de ADN de anticuerpo informador — ADN se vincularon a un soporte solid° revestido con los diferentes antigenos. Las multiples etiquetas de ADN fueron detectadas de forma simultanea en el ensayo en base a los tamafios de los productos de amplificacion de PCR respectivos, que habian sido diseriados para permitir la resolucion de cada uno de los otros por electroforesis de gel.

El Inmuno-PCR ofrece una mejora real en sensibilidad sobre los inmunoensayos actuales, pero presenta un gran ninnero de oportunidades por lo que se refiere a generar fondo. El fondo puede generarse a partir del enlace no especifico de cualquier componente, incluyendo el conjugado de anticuerpo—ADN informador, la proteina quimerica u otro componente de etiquetado secundario. Dado que las moleculas individuales de acid° nucleic° pueden ser detectadas por el PCR, si se deja de eliminar todas las moleculas de ADN modelo no especificamente unidas, ello provoca un fondo significativo, e interfiere con la capacidad de detect& cantidades minitsculas de analito. Los lavados astringentes, numerosos o prolongados para reducir los productos no especificos han sido utilizados para reducir el fondo, pero pueden tener como resultado una serial reducida debido a la elucion o la disociacion de complejos de antigenos/anticuerpos. De la misma manera, el Inmuno-PCR esti, limitado por la ya conocida no-linealidad del PCR, que puede frustrar los intentos de evaluar las

cantidades proporcionadas de analito presentes. Estas diferencias practicas han

impedido que las tecnicas de Inmuno-PCR consigan una aceptaciOn y una utilidad globales en este campo.

Se ha sugerido una gran variedad de metodos para reducir el fondo en metodos tanto de inmunoensayo standard como de Inmuno-PCR. Ishikawa et al. (U. S. Pat. No. 5, 888, 834) han propuesto la tecnica de inmunoensayo de transferencia de complejos inmunes, en la cual un complejo inmune sandwich es liberado del soporte de captura y recapturado sobre una superficie nueva. Los componentes informadores no especificamente unidos quedan en el soporte solid° inicial. La sensibilidad del ensayo de hibridacion del acido nucleico tambien ha experimentado una mejora, mediante la elucion quimica del ADN hibridizado desde un soporte solid°, dejando atras las sondas de ADN informador no especificamente unidas (verMorrissey, etal., AnalBiochem 1989, 181: 345-359) . El ADN objetivo fue hibridizado con una sonda de captura de cola dA y una sonda informadora etiquetada. Id. El complejo fue capturado en gotas paramagneticas revestidas con oligo dT. Id. Despues de lavarlo, el complejo fue liberado mediante elucion con... [Seguir leyendo]

1. Un kit para detectar un analito de acid° no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento, que comprende:

(i) un primer contenedor que contiene un anticuerpo de captura unido a un soporte solid° con un puente de acid° nucleico que consta de dos hebras de acido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de las cuales esta unida a un soporte sOlido;

(ii) un segundo contenedor que tiene un conjugado del mismo anticuerpo o de un anticuerpo diferente y una molecula de marcador de acido nucleico; y

(iii) un tercer contenedor que contiene un acido nucleico desplazador que tiene una secuencia por lo menos parcialmente complementaria a una de las hebras del puente de acid° nucleico.

2. Un kit para detectar un analito de acido no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento, que comprende:

(i) un primer contenedor que comprende moleculas de ADN activadas quimicamente utilizando un compuesto de reticulacion que va a ser unido de forma covalente a una proteina o anticuerpo de enlace de ligando, en que la proteina o anticuerpo de enlace de ligando es capaz de unir de forma especifica el analito de acid° no nucleico, en que las moleculas de ADN comprenden (a) una primera hebra de un puente de acid° nucleic°, y (b) una primera hebra de una molecula de ADN marcador, en que dichas dos hebras son distintas y no complementarias entre si;

(ii) un segundo contenedor que comprende moleculas de ADN complementarias, en que las moleculas de ADN complementarias comprenden: (a)

moleculas de ADN conjugadas a un ligando, en que las moleculas de ADN son sustancialmente complementarias a la primera hebra del puente de acid° nucleico, (b) moleculas de ADN sustancialmente complementarias a la primera hebra de la molecula de ADN marcador, y (c) moleculas de ADN de hebra de desplazador que son complementarias en su totalidad o en parte a la hebra del puente de acido nucleico; y

(iii) direcciones para detectar un analito de acid° no nucleico utilizando el kit.

3. El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que las moleculas de ADN activadas son activadas con disuccinimidil suberato.

4. El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que las moleculas de ADN activadas son activadas con ester maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida disuccinimidil suberato.

5. El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que el ligando es biotina.

6. Un kit para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos, que comprende:

(i) un primer contenedor que comprende moleculas de ADN activadas quimicamente utilizando dissuccinimidil suberato para ser unidas de forma covalente a una proteina o anticuerpo de union de ligando, en que las moleculas de ADN son (a) una primera hebra de un puente de acido nucleico, y (b) una primera hebra de una molecula de ADN marcador, en que dichas dos hebras son distintas y no complementarias entre Si; y

(ii) un segundo contenedor que comprende moleculas de ADN de hebra de desplazador que son complementarias en su totalidad o en parte a la hebra del puente de acid° nucleico; y

(iii) direcciones para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos utilizando el

kit.

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RFU Sustraido de la Linea de Base PCR

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citada por el solicitante es para facilitar la comprensión

del lector unicamente. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido un cuidado extremado a la hora de recopilar las referencias, no pueden descartarse errores u omisiones, y la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

• Documentos de patente citados en la descripcion:

• EP 1249500 A [0007]

• US 5985548 A [0008] [0070]

• US 5888834 A [0010]

• US 5702896 A, Collins [0010]

• US 4376110 A [0027]

• US 4946778 A [0029]

• WO 0041524 A [0043] [0053]

• US 5270184 A [0043] [0053]

• US 5766849 A [0043] [0053]

• Documentos no de patente citados en la descripcion:

• SANO et al. Science, 1992, vol. 258.

12. 22 [0003]

• JOERGER et al. Clin Chem, 1995, vol. 41, 1371-77 [0006]

• HENDRICKSON at al. NucleicAcidsRes, 1995, vol. 23.

52. 529 [0006]

• MORRISSEY at al. Anal Biochem, 1989, vol. 181, 345-359 [0010]

• MCKIE at al. J. immunol.Meth., 2002, vol. 261, 167175 [0011]

• KOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495-7 [0027]

• KOSBORat al. ImmunologyToday, vol. 4, 72 [0027]

• COTE at al. Proc.Natl.Acad.Sol.USA, 1983, vol. 80, 2026-30 [0027]

• COLE at al. Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1985.

7. 96 [0027]

• MORRISON at al. Proc.Natl.Acad.Sc!., 1984, vol. 81, 6851-6855 [0028]

• TAKEDAet al. Nature, 1995, vol. 314.

45. 54 [0028]

• BIRD. Science, 1988, vol. 242.

42. 26 [0029]

• HUSTON at al. Proc.Natl.Acad.Sc, .USA, vol. 85, 5879-83 [0029]

• WARDat al. Nature, 1989, vol. 334.

54. 46 [0029]

• HUSEet al. Science, 1989, vol. 246, 1275-81 [0030]

• TYAGI; KFtAMER. Nat Biotechnol, 1996, vol. 14, 303-308 [0034]

• WAG! et al. NatBlotechnol, 2000, vol. 18, 1191-96 [0034]

• SAMBROOK; RUSSELL. Molecular Cloning, a Laborator y Manual. 2001 [0043]

• WU; WALLACE. Genomics, 1989, vol. 4, 560 [0043]

• WU, D.Y. ; R.B. WALLACE. Genomics, 1989, vol. 4, 560 [0053]

• WALKER. Sc!, 2002, vol. 296.

55. 58 [0055]

• SUGAWAFtA at al. ClintChem.Act, 2000, vol. 299, 45-54 [0070]

• SAITO at al. Clin Chem. , 1999, vol. 45 (5) .

66. 669 [0070]

• FURUYA at al. J. ImmunoLMethods, 2000, vol. 238, 173-180 [0070]

• JOERGER at al. Clin Chem, 1995, vol. 41 (9) , 1371-1377 [0070]

• HENDRICKSON at al. Nucl.AcidsRes., 1986, vol. 14, 6115-28 (0070]

• JABLONSKI at al. Nucl. Acids Res. , 1995, vol. 23 (3) .

52. 29 [0070]

• HERMANSON. Bloconjugate Techniques, 1996, 639-666 [0070]

• WALKER. Science, 2002, vol. 296.

55. 58 [0079]

TRADUCCION DEL FASCICULO DE UNA PATENTE EUROPEA CONCEDIDA, OUE DESIGNA A ESPASTA, PARA LA PROTECCION EN ESPAN-A DE SU OBJETO

Titular :

IRIS INTERNATIONAL, Inc.

N° de publicacion de la patente europea :

EP 2 290 100 B1

Referencias del Boletin europeo de patentes

en el que aparece la publicacion de la menciOn

de la concesiOn :

19 — Febrero — 2014 Boletin 2014/08

La presente traducción del texto ingles el fasciculo de patente europea n° 2 290 100 B1

concedida con designacion de Espaiia, ha sido realizada, para dar cumplimiento a lo establecido en el Decreto 242/1986 de 10 de Octubre de 1986, con la intervencion de Agente de la Propiedad Industrial, acreditado ante la Oficina Espariola de Patentes y Marcas.

Barcelona, 05 de Mayo de 2014

EL AGENTE DE LA PROPLEDAD INDUSTRIAL

LLAGOSTERA SOTO, Ma del Carmen Colegiado n° 478