INMUNIZACION MEDIADA POR BACTERIOFAGOS CONTRA LA HEPATITIS.

Una formulación que comprende una partícula de bacteriófago, cuya superficie no ha sido modificada para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago diseñada para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células específicos y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo,

la partícula de bacteriófago comprende una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido del virus de la hepatitis bajo control de un promotor eucariótico para uso en el desencadenamiento de una respuesta inmune para dicho polipéptido en un organismo

Inmunización mediada por bacteriófagos contra la hepatitis.

La presente invención se refiere a vacunas que comprenden un bacteriófago diseñado para expresar una proteína/péptido inmunogénico.

La vacunación genética es una nueva y prometedora técnica en la que se usa ácido nucleico como el material de vacuna (para una revisión véase Leitner y col. 2000. Vaccine 18: 765-777). Por el contrario las vacunas tradicionales requiere el uso de microbios patogénicos o sus componentes antigénicos. Hay tres clases de vacunas "tradicionales": atenuadas, de virus muertos/de subunidades y recombinantes. Las vacunas atenuadas son microorganismos vivos con patogenicidad reducida y son por lo general las vacunas más efectivas. No obstante, estas pueden producir complicaciones si el agente de la vacuna crece descontroladamente o revierte a una forma más patogénica. Las vacunas de virus muertos o de subunidades requieren múltiples inyecciones, con lo que aumenta el coste y se generan problemas logísticos, y pueden contener microbios no completamente muertos. Las vacunas recombinantes en las que un antígeno de un organismo patogénico es diseñado en un vector no patogénico pueden ser efectivas pero las dificultades en la consecución de la expresión del antígeno en una conformación nativa limita frecuentemente la eficacia.

Para ser efectivas las vacunas necesitan proporcionar una dosis suficiente de antígeno para periodos de tiempo suficientemente prolongados para inducir una respuesta secundaria (memoria). Esto representa un problema para las vacunas tradicionales; las vacunas de ADN/ARN, no obstante, pueden producir de forma efectiva copias de antígenos patogénicos durante prolongados periodos de tiempo e inducir así respuestas de MHC de clase I y II, como se observa con vacunas vivas. Sin embargo las vacunas de ADN aún tienen que desarrollar todo su potencial. A pesar de desencadenar una respuesta inmune humoral (anticuerpo) medible, muchas vacunas de ADN muestran poca eficacia cuando se exponen al organismo infectivo (Beard, CW & Mason, PW. 1998. Nature Biotech. 16: 1325).

En la actualidad no está claro el mecanismo por el que el ácido nucleico se introduce en células del huésped e induce una respuesta inmune. La técnica más simple es administrar el ADN como una inyección soluble, normalmente administrada por vía intramuscular. Otras dos técnicas de uso común son la técnica de "pistola génica", en la que se precipita ADN sobre partículas de oro diminutas que son forzadas dentro de las células con una corriente de helio, o transfección mediada por liposomas, en la que se recubre ADN con lípido cargado positivamente para formar un complejo que funde con la membrana de la célula huésped. Se cree que las células que rodean el sitio de inmunización recogen el ADN, expresan el(los) antígeno(s) codificado(s), y son reconocidos como "extraños" por las células que presentan antígeno (AP) del sistema inmune, que luego proceden a activar células A y B desencadenando una respuesta inmune frente al antígeno.

Las limitaciones parecerían ser: (1) la expresión es relativamente ineficiente y no específica, expresándose la mayor parte del ADN en células no AP; (2) la expresión de antígenos extraños en células no AP conduciría eventualmente a la muerte de esa célula debido a su reconocimiento como "infectada" por parte del sistema inmune del huésped, acortando así la respuesta inmune potencial; y (3) el ADN/ARN desnudo es altamente sensible a la acción de nucleasas. Es probable que la mayor parte del ácido nucleico usado para inmunización se degrade poco después de la inmunización.

El documento WO 98/0534 describe un procedimiento para la liberación de genes exógenos usando un vector bacteriófago en el que el vector bacteriófago se ha visto modificado para incluir en su superficie un ligando que se une a un receptor en una célula diana. Por lo general se pretende que se usen los vectores descritos para aplicaciones de terapia génica donde los vectores se dirigen a tipos específicos de células. También se hace mención al uso de los vectores bacteriófagos modificados para liberar péptidos antigénicos.

El documento US 5.736.388 describe bacteriófagos lamboides modificados para liberación de moléculas de ácido nucleico en células eucarióticas en las que el bacteriófago se ha visto modificado por incorporación de proteínas de fibra de cola mutante o por incorporación de ligandos para receptores de células eucarióticas.

El documento US 6.054.312 se refiere a partículas de fago filamentosas que muestran un ligado en su superficie, siendo el ligando una proteína de fusión con una proteína de la cápsida del fago, conjugada covalentemente con partículas de fago, o complejada con partículas de fago modificadas.

El documento WO 99/55720 también describe fagos que se han modificado para mostrar externamente una proteína de direccionamiento heteróloga para uso en liberación direccionada de genes.

Sin embargo, las patentes/solicitudes de patente anteriormente citadas describen todas ellas la modificación de la superficie del fago, de modo que permita la liberación dirigida de ácido nucleico a células específicas, por lo general para fines de terapia génica.

Un número de documentos (Ishiura, M. y col, Molec. And Cell. Biol., páginas 607-616, 1982; Aujame, L. y col., Biotechniques, 28 páginas 1202-1213, 2000; Horst, J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, páginas 3531-3535, 1975; Jkayama y Dery, Molec. y Cell. Biol. 5, páginas 1136-1142, 1985; y Srivatsan, E. y col, 38, páginas 227-234, 1984) se refieren al uso de fagos para transfectar células de mamífero cultivadas y expresar proteínas en su interior. Sin embargo, no hay sugerencia alguna de que se podrían aplicar in vivo, o usarse en el desarrollo de vacunas.

Es un objeto de la presente invención solventar y/o mitigar al menos una de las desventajas anteriormente citadas.

En un primer aspecto la presente invención proporciona una formulación de vacuna de la hepatitis que comprende una partícula de bacteriófago, cuya superficie no está modificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, comprendiendo la partícula de bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido del virus de la hepatitis que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo, tal que se aumenta en el organismo una respuesta inmune respecto a dicho polipéptido.

A diferencia de las divulgaciones previas, véanse por ejemplo los documentos WO 98/05344, US 5.736.388, US 6.054.312 y WO 99/55720, se tiene que apreciar que el bacteriófago de superficie de la presente invención no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenas (es decir péptidos/proteínas no presentes normalmente) en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células. Se debe entender por lo tanto que la superficie del bacteriófago se puede modificar para comprender péptidos/proteínas exógenas no diseñadas para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células.

Se entiende que la vacuna de la hepatitis se puede usar para vacunar contra cualquier virus de la hepatitis, por ejemplo, tipos A, B, C, D o E, preferiblemente del tipo B. El antígeno expresado y presentado en la superficie de la célula AP puede ser un antígeno de superficie tal como el antígeno de superficie de hepatitis B (HBs), si bien se pueden expresar otras proteínas de hepatitis que pueden facilitar una respuesta inmune.

Además se puede diseñar un bacteriófago para expresar más de un antígeno de hepatitis y, por ejemplo, poder expresar antígenos de más de un tipo de hepatitis.

Los presentes inventores han observado que una dosis elevada de partículas de bacteriófago parece dar lugar a una mejor respuesta inmune que se ve potenciada. Por tanto, preferiblemente se administran más de 10⁹ bacteriófagos con la dosis al animal, tal como más de 10¹⁰ ó 10¹¹ partículas de bacteriófago.

Por tanto, en un segundo aspecto se proporciona una formulación de vacuna que comprende más de 10⁹ partículas de bacteriófagos, estando sin modificar la superficie de cada partícula, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, comprendiendo dichas partículas de bacteriófagos una molécula de ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie...

1. Una formulación que comprende una partícula de bacteriófago, cuya superficie no ha sido modificada para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago diseñada para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células específicos y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo, la partícula de bacteriófago comprende una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido del virus de la hepatitis bajo control de un promotor eucariótico para uso en el desencadenamiento de una respuesta inmune para dicho polipéptido en un organismo.

2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, para uso como una vacuna.

3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 2, para uso en la vacunación frente a hepatitis de tipos A, B, C, D y/o E.

4. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el polipéptido es un antígeno de superficie de la hepatitis.

5. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago ha sido diseñado para expresar más de un antígeno de la hepatitis.

6. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende más de 10⁹ partículas de bacteriófago.

7. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es capaz de desencadenar una respuesta inmune humoral y/o celular.

8. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago comprende reguladores transcripcionales y/o translacionales para facilitar la expresión del polipéptido.

9. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el promotor eucariótico es el CMV, SV40, timidina quinasa o promotor RSV.

10. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende el ácido nucleico exógeno con control de un promotor constitutivo y un promotor controlable.

11. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago es lambda (?), fago p1, fago T, Mu, fd, M13 o un fago filamentoso.

12. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago es capaz de expresar copias simples o múltiples de un polipéptido o una pluralidad de polipéptidos.

13. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago es abortivo para el crecimiento lítico en la flora bacteriana natural del huésped mamífero seleccionado.

14. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende inhibidores de catabolismo enzimático lisosomal/endosomal y/o señales de localización nuclear.

15. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una cantidad del polipéptido a expresar por el bacteriófago.

16. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago ha sido modificado para expresar el polipéptido en la superficie de la partícula de fago, dicho polipéptido no está diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células.

17. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el ácido nucleico exógeno también codifica un polipéptido capaz de aumentar la respuesta inmune.

18. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además un adyuvante.

19. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el bacteriófago está asociado con un vehículo.

20. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad en un ser humano o animal.

21. Uso de una partícula de bacteriófago cuya superficie no ha sido modificada para comprender péptidos/proteínas exógenas en la superficie del fago diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células, comprendiendo la partícula de bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de virus de la hepatitis bajo control de un promotor eucariótico, para la preparación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune frente al polipéptido del virus de la hepatitis expresado en un organismo.