Inhibidores de proteína fosfatasa 1, de GADD34 y del complejo de proteína fosfatasa 1/GADD34, y usos de los mismos combinados con etopósido o mitomicina C.

El uso de un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteínafosfatasa 1 (PP1),

un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con unproducto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para preparar unacomposición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.

Inhibidores de proteína fosfatasa 1, de GADD34 y del complejo de proteína fosfatasa 1/GADD34, y usos de los mismos combinados con etopósido o mitomicina C

Campo de la invención La presente descripción se refiere a proteínas aisladas y purificadas, tales como calreticulina (CRT) , receptor de KDEL y ERp57, así como a cualquier compuesto que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula moribunda y, así, induce una reacción del sistema inmunológico. Los inventores, en concreto, han descubierto que dichas proteínas y compuestos pueden utilizarse en combinación con un compuesto citotóxico o un inductor de la apoptosis para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer o una infección en un mamífero, en particular para mejorar la eficacia de una terapia, preferiblemente una terapia del cáncer, en un mamífero que lo necesite.

El presente texto describe además kits, métodos para detectar la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula, métodos para seleccionar un compuesto de interés, así como composiciones farmacéuticas.

Antecedentes de la invención El cáncer es la principal causa de mortalidad en la mayoría de los países industrializados. Pueden utilizarse diferentes modos de tratamiento del cáncer: cirugía, radioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia y quimioterapia. Numerosos laboratorios de investigación están realizando trabajos para descubrir mejoras para la terapia del cáncer. La quimoterapia conduce a la muerte celular. Se conocen dos tipos de muerte celular: la apoptosis y la necrosis.

Desde hace tiempo, se ha establecido la hipótesis de que la muerte celular apoptótica sería muy poco inmunogénica (o incluso tolerogénica) , mientras que la muerte celular necrótica sería verdaderamente inmunogénica (Bellamy, C.O., Malcomson, R.D., Harrison, D.J. y Wyllie, A.H., Semin. Cancer Biol., 6, 3-16 (1995) ; Thompson, C.B., Science, 267, 1456-1462 (1995) ; Igney, F.H. y Krammer, P.H., Nat. Rev. Cancer, 2, 277-288 (2002) ) .

Se pensaba que esta diferencia era el resultado de la capacidad intrínseca de las células que mueren por una muerte celular no apoptótica para estimular una respuesta inmunológica, por ejemplo, mediante la estimulación de respuestas inflamatorias locales ("señales de peligro") y/o mediante la activación de la maduración de células dendríticas (DC) (Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. e Inaba, K., J. Exp. Med., 191, 411-416 (2000) ; Liu, K. et ál., J. Exp. Med., 196, 1091-1097 (2002) ) .

Por contraste con la necrosis (que se define por una ruptura brusca de la membrana plasmática) , la apoptosis está asociada con una serie de alteraciones sutiles en la membrana plasmática que hacen que las células moribundas sean comestibles para las células fagocíticas (Kroemer, G. et ál., Cell Death Differ, 12, 1463-1467 (2005) ) . Estas señales de "cómeme", que incluyen la adsorción de proteínas solubles del exterior de la célula (tales como C1q y trombospondina) y la translocación de moléculas desde el interior de la célula hacia la superficie (tales como fosfatidilserina, PS, y calreticulina, CRT) , así como la supresión de las señales de "no me comas" (tales como CD47) (Savill, J. y Fadok, V., Nature, 407, 784 (2000) ; Lauber, K., Blumenthal, S.G., Waibel, M. y Wesselborg, S., Mol. Cell., 14, 277-287 (2004) ; Yoshida, H. et ál., Nature, 437, 754-758 (2005) ; Gardai, S.J. et ál., Cell, 123, 321-334 (2005) ; Henson, P.M. y Hume, D.A., Trends Immunol., 27, 244-250 (2006) ) suscitan el reconocimiento y la eliminación de las células apoptóticas por fagocitos profesionales y no profesionales. La eliminación subóptima de células apoptóticas puede activar reacciones inmunológicas injustificadas y conducir a una enfermedad autoinmunológica (Hanayama,

R. et ál., Science, 3004, 1147-1150 (2004) ; Gaipl, U.S. et ál., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 305, 161-176 (2006) ) .

No obstante, parece que la dicotomía entre la necrosis inmunogénica frente a la apoptosis tolerogénica es una simplificación excesiva. Así, la muerte de células tumorales no programada (necrótica) puede inducir una inmunosupresión local (Vakkila, J. y Lotze, M.T., Nat. Rev. Immunol., 4, 641-648 (2004) ) . Además, se ha descubierto que la capacidad de las células tumorales apoptóticas para activar una respuesta inmunológica depende del inductor de la apoptosis, lo cual conduce a la identificación de dos subcategorías de la apoptosis morfológicamente indistinguibles, concretamente la apoptosis inmunogénica frente a la no inmunogénica (Casares, N. et ál., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005) ; Blachere, N.E., Darnell, R.B. y Albert, M.L., PLoS Biol., 3, e185 (2005) ) .

La mayoría de las quimioterapias convencionales inducen una apoptosis no inmunogénica (Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. y Kroemer, G., Adv. Immunol., 84, 131-179 (2004) ; Steinman, R.M. y Mellman, I., Science, 305, 197-200 (2004) ; Lake, R.A. y van der Most, R.G., N. Engl. J. Med., 354, 2503-2504 (2006) ) . Así, incluso después de una quimioterapia inicialmente eficaz, los pacientes no desarrollan una respuesta inmunológica antitumoral eficaz, y después son vencidos por variantes tumorales resistentes a quimioterapia. Para mejorar la quimioterapia anticáncer, una vía prometedora es la muerte de células cancerosas inmunogénica. En efecto, la inducción de la muerte de células cancerosas inmunogénica debería ser muy interesante, porque el sistema inmunológico puede contribuir, a través de un "efecto espectador", a erradicar las células cancerosas resistentes a quimioterapia y las células precursoras cancerosas (Steinman, R.M. y Mellman, I., Science, 305, 197-200 (2004) ;

Lake, R.A. y van der Most, R.G., N. Engl. J. Med., 354, 2503-2504 (2006) ; Zitvogel, L., Tesniere, A. y Kroemer, G., Nat. Rev. Immunol., en imprenta (2006) ) .

La eficacia de la quimioterapia y la capacidad de respuesta están relacionadas con los fármacos utilizados y con las moléculas implicadas en la quimioterapia. Los principales fármacos utilizados en la quimioterapia antitumoral pueden dividirse en cuatro grupos: agentes citotóxicos, hormonas, moduladores de la respuesta inmunológica, e inhibidores de la actividad tirosina quinasa. Entre los agentes citotóxicos se pueden encontrar antibióticos citotóxicos, tales como antraciclinas (doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, que son inductores de la apoptosis) . Los inventores han demostrado, por primera vez, que las antraciclinas son capaces de provocar una apoptosis inmunogénica (Casares, N., Pequignot, M.O., Tesniere, A., Ghiringhelli, F., Roux, S., Chaput, N., Schmitt, E., Hamai, A., Hervas-Stubbs, S., Obeid, M., Coutant, F., Métivier, D., Pichard, E., Aucouturier, P., Pierron, G., Garrido, C., Zitvogel, L., y Kroemer, G., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005) ) . En efecto, mientras que la mayoría de los inductores de la apoptosis, incluyendo los agentes que se dirigen al retículo endoplásmico (RE) (tapsigargina, tunicamicina, brefeldina) , las mitocondrias (arsenita, ácido betulínico, C2-ceramida) o el ADN (Hoechst 33343, camptotecina, etopósico, mitomicina C) , no inducen una apoptosis inmunogénica, las antraciclinas provocan la muerte celular inmunogénica (tal como se muestra en la figura 1B, C) . A pesar del creciente cuerpo de investigación, sigue estando abierta la cuestión de cuáles son las circunstancias bajo las que se activa una respuesta inmunológica contra células tumorales moribundas (Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. y Kroemer, G., Adv. Immunol., 84, 131179 (2004) ) .

La presente invención se basa en la observación de que las proteínas denominadas calreticulina (CRT) , receptor de KDEL (el receptor de KDEL es un receptor de CRT) y ERp57 son expuestas sobre células que sucumben a la muerte celular inmunogénica, pero no aparecen en la superficie de células que sufren una muerte celular no inmunogénica.

La CRT ya ha sido descrita para la modulación de la respuesta hormonal, otra vía de tratar el cáncer. Las proteínas que modulan la transcripción de genes inducida por el receptor de hormonas están presentes en el núcleo de la célula, e inhiben o estimulan la unión de una hormona a su receptor. La invención descrita en la patente US 2003/0060613 A1 presenta una proteína purificada, eficaz en una terapia anticáncer, que se emplea para modular la capacidad de respuesta a hormonas. La patente US 2003/0060613 A1 describe la CRT como una proteína sintética, una proteína mimética de esta, una molécula de ADN que codifica CRT, un método para tratar una enfermedad, tal como cáncer, y un kit que contiene un producto farmacéutico... [Seguir leyendo]

1. El uso de un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1) , un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.

2. Un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1) , un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para su uso para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.

3. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor es un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1) seleccionado de tautomicina y caliculina A.

4. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor es un inhibidor del complejo de PP1/GADD34 seleccionado de salubrinal y un fragmento de GADD34 que consiste en una secuencia que comprende entre 5 y 35 aminoácidos de SEQ ID NO:1.

5. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el fragmento de GADD34 tiene la secuencia LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:2) .

6. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 4 o 5, en el que el fragmento de GADD34 comprende también un motivo de translocación hacia la membrana plasmática que es capaz de unirse a la superficie de una célula tumoral.

7. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 6, en el que la célula tumoral procede de un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un melanoma, un tumor pediátrico y un tumor leucémico.

8. El uso o la composición para el uso según la reivindicación 6 o 7, en el que la secuencia del motivo de translocación es VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:3) .

9. El uso o la composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la secuencia del péptido es VKKKKIKREIKI-LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:4) .

10. El uso o la composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el cáncer se selecciona de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de colon, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un osteosarcoma, un GIST, un melanoma, una leucemia y un neuroblastoma.

11. Un método in vitro para seleccionar un péptido capaz de inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en una célula, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un péptido de ensayo que comprende un fragmento de secuencia dentro de SEQ ID NO:1, o un fragmento homólogo de este,

b) poner en contacto el péptido de ensayo de la etapa a) con la célula, y

c) detectar y/o medir el nivel de exposición de la calreticulina (CRT) , del receptor de KDEL y/o de ERp57 sobre la superficie de dicha célula, en el que una mayor exposición, en comparación con una célula control que no se ha puesto en contacto con el péptido de ensayo, o que se ha puesto en contacto con un mutante de dicho péptido de ensayo, es indicativa de una inhibición de la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en la célula.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la secuencia de la etapa a) comprende entre 5 y 35 aminoácidos.