Péptido quimérico que comprende un primer dominio y un segundo dominio enlazados por un enlace covalente,

comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 8 o 10 y que dirige el péptido quimérico a través de la membrana plasmática y/o hacia una localización celular deseada, y comprendiendo el segundo dominio una secuencia inhibidora de JNK, donde el péptido inhibidor de JNK tiene una longitud inferior a 280 aminoácidos.

Inhibidores peptídicos con permeabilidad celular de la ruta de transducción de la señal jnk

En general, esta invención se refiere a inhibidores de proteína quinasa y, de forma más específica, a inhibidores de la proteína quinasa c-Jun amino terminal quinasa.

La quinasa c-Jun amino terminal (JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de las quinasas proteicas mitógeno-activadas (MAP) . Estas quinasas están implicadas en el control del crecimiento y la diferenciación celular, y, en general, en la respuesta de las células a los estímulos ambientales. La ruta de transducción de las señales JNK se activa en respuesta al estrés ambiental y mediante el empleo de diversos tipos de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citoquinas, receptores de serpentinas y receptor tirosina-quinasa. En las células de mamíferos, la JNK está involucrada en procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y en la mediación de respuestas adaptivas al estrés ambiental. La JNK también se asocia a la modulación de las respuestas inmunes, incluyendo la maduración y la diferenciación de las células inmunes, así como a la puesta en marcha de la muerte celular programada en células identificadas para la destrucción por el sistema inmune.

En Bonny y col. (The Journal of Biological Chemistr y , Vol. 273, No. 4, p. 1843 - 1846, 1998) se describe el clon de expresión de un cADN de rata que codifica un proteína nuclear derivada de JIP-1 a partir de una librería de cADN de células pancreáticas º, al cual los autores denominan IB1 (por Islet-Brain 1) . El cADN de IB1 codifica una proteína de 714 aminoácidos que difiere de JIP-1 en la inserción de 47 aminoácidos en la parte carboxilo terminal de la proteína. El resto de los 667 aminoácidos son, en un 97%, idénticos a JIP-1. Los datos demostraron que IB1 es una proteína ADNenlazante relacionada con JIP-1 que es altamente expresada en las células pancreáticas º y que funciona como un transactivador del gen GLUT2.

La publicación de patente internacional WO 98/49188 se refiere igualmente a la proteína de interacción con JNK1 (JIP1) , a un inhibidor de la proteína JNK1, a un método para el tratamiento de una condición patológica o de prevención de la misma en un paciente mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptidos, péptidos, péptidos miméticos o ácidos nucleicos de JIP-1.

La publicación de patente internacional WO 1994/004686, de Biogen Inc., se refiere al suministro de moléculas biológicamente activas, tales como polipéptidos y ácidos nucleicos, transportadoras al citoplasma y al núcleo celular in vitro e in vivo mediante el uso de nuevos polipéptidos de trasporte que comprenden una o más partes de la proteína HIV TAT y que se unen de forma covalente a las moléculas transportadoras. Los polipéptidos de transporte de esta invención se caracterizan por la presencia de la región básica de TAT (aminoácidos 49 - 57) , la ausencia de la región de cisteína de TAT (aminoácidos 22 - 36) y la ausencia del dominio carboxiterminal que codifica el exón-2 de TAT (aminoácidos 73 - 86) de la proteína TAT nativa. La ausencia de la región tica en cisteína que se encuentra en las proteínas TAT convencionales soluciona los problemas de la falsa transactivación y de la agregación de disulfuros.

Bessalle y col. (FEBS Letters, Vol. 274, No. 12, p. 151 - 155, 1990) describen la síntesis de una magainina-2 todo-D para corroborar experimentalmente la idea de que la función biológica de un péptido tensioactivo se deriva principalmente de su estructura alfa helicoidal anfifílica única. De hecho, el péptido mostró una potencia antibacteriana casi idéntica a la del enantiómero todo-L. Al ser altamente resistente a la proteólisis y no hemolítica, se consideró que la magainina todo-D tenía una importancia terapéutica considerable.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de péptidos que son inhibidores eficaces de las proteínas JNK. Los péptidos, denominados aquí inhibidores peptídicos de JNK, disminuyen los efectos proliferativos en las células aguas abajo de la quinasa c-Jun amino terminal (JNK) .

La invención comprende péptidos quiméricos que incluyen un inhibidor peptídico de JNK enlazado a un péptido de tráfico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 10, que puede emplearse para dirigir un péptido en el cual está presente a una localización celular deseada. La secuencia de tráfico se puede utilizar para dirigir el transporte del péptido a través de la membrana plasmática. Alternativamente o además, el péptido de tráfico se puede utilizar para dirigir el péptido hacia el lugar intracelular deseado, por ejemplo al núcleo.

Los péptidos inhibidores de JNK pueden estar presentes como polímeros de L-aminoácidos. Alternativamente, los péptidos pueden estar presentes como polímeros de D-aminoácidos.

También están incluidas en la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos de unión de JNK, así como anticuerpos que reconocen específicamente los péptidos de unión de JNK.

En otro aspecto, la invención incluye el uso de los péptidos quiméricos de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar patofisiologías asociadas a la activación de JNK en una o más células. Por ejemplo, las células diana pueden ser células animales, humanas o microorganismos, cultivados. El suministro puede llevarse a cabo in vivo mediante la administración del péptido quimérico a un individuo, al cual se aplica con fines diagnósticos, preventivos o terapéuticos. Las células diana pueden ser células in vivo, es decir células que forman parte de los órganos o tejidos de animales vivos o humanos, o microorganismos encontrados en animales vivos o humanos.

Entre las ventajas proporcionadas por la invención, los péptidos inhibidores de JNK son pequeños y se pueden producir fácilmente en cantidades masivas y con una gran pureza. Los péptidos inhibidores son también resistentes a la degradación intracelular y son escasamente inmunogénicos. En consecuencia, los péptidos se adaptan bien a aplicaciones in vitro e in vivo en las que se desea la inhibición de la expresión de JNK.

Salvo definido de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un especialista en el campo de la técnica al que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o en las pruebas de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, regirá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1A-C: son diagramas que muestran las alineaciones de las regiones de dominios JBD conservadas en los factores de transcripción indicados.

Fig. 2: diagrama que muestra las alineaciones de péptidos genéricos de fusión TAT-IB.

Fig. 3: histograma que describe la inhibición de la muerte de células-ínimo de 23

por el dominio JBD maminoácidos de tamaño de IB1 en comparación con el dominio de JBD completo, de 280 aminoácidos.

Fig. 4: ilustración que demuestra los efectos de los péptidos TAT, TAT-IB1 y TAT-IB2 sobre la fosforilación de JNK recombinantes. El panel A muestra la inhibición de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por los JNK recombinantes in vitro. El panel B muestra experimentos de dosis-respuesta similares a los del Panel A.

Fig. 5: histograma que describe la inhibición de la fosforilación de L-TAT-IB por JNK recombinantes. El panel A muestra la inhibición de L-TAT-IB de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por los JNK recombinantes in vitro en presencia de MKK4. El panel B muestra experimentos de dosis-respuesta similares con MKK7.

Fig. 6: ilustración que demuestra la inhibición de la fosforilación de c-Jun por JNK activados.

Fig. 7: histograma que describe la inhibición a corto plazo de la muerte de células-del... [Seguir leyendo]

1. Péptido quimérico que comprende un primer dominio y un segundo dominio enlazados por un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 8 o 10 y que dirige el péptido quimérico a través de la membrana plasmática y/o hacia una localización celular deseada, y comprendiendo el segundo dominio una secuencia inhibidora de JNK, donde el péptido inhibidor de JNK tiene una longitud inferior a 280 aminoácidos.

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de tráfico aumenta la captación celular del péptido.

3. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de tráfico dirige la localización nuclear del péptido.

4. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia inhibidora de JNK se une a JNK.

5. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia inhibidora de JNK inhibe la activación de al menos un factor de transcripción diana de JNK.

6. Péptido según la reivindicación 5, caracterizado porque el factor de transcripción diana de JNK se selecciona de entre el grupo consistente en C-Jun, ATF2 y Elk1.

7. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia inhibidora de JNK altera los efectos inducidos por JNK cuando se introduce en una célula que expresa JNK.

8. Péptido según la reivindicación 7, caracterizado porque el efecto inducido por JNK se selecciona de entre el grupo consistente en restenosis, transformación oncogénica, maduración y diferenciación de células inmunes, isquemia, reperfusión, hipoxia, hipotermia, hipertermia, apoptosis y respuesta a estímulos estresantes.

9. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido inhibidor de JNK tiene una longitud inferior a 50 aminoácidos.

10. Composición que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, así como un vehículo.

11. Utilización de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una patofisiología asociada a la activación de JNK en un sujeto, donde la patofisiología se selecciona de entre malignidades que incluyen malignidades de pulmón, pecho, tejido linfoide, tracto gastrointestinal y genito-urinario, leucemia, adenocarcinomas, incluyendo cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, carcinoma de células no-pequeñas de pulmón, cáncer de intestino delgado, cáncer de esófago y cánceres con transformación oncogénica Bcr-Abl, y enfermedades proliferativas de células no-malignas o asociadas al aspecto inmunológico seleccionadas de entre psoriasis, restenosis, vasculitis, pénfigo vulgar, síndrome de Behcet, artritis reumatoide, síndrome de sufrimiento respiratorio agudo (ARDS) , enfermedad cardiaca isquémica, síndrome de postdiálisis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, histiocitosis lipídica y shock séptico, diabetes y patofisiologías inducidas por radiación ionizante, radicales libres, agentes que dañan el ADN o luz UV.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el péptido bloquea la activación de al menos un factor de transcripción diana de JNK.

13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque el factor de transcripción diana de JNK se selecciona de entre el grupo consistente en c-Jun, ATF2 y Elk1.

14. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque el factor de transcripción diana de JNK es C-Jun.

15. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque el medicamento es adecuado para su suministro

por cualquier vía de administración seleccionada de entre el grupo consistente en administración intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y con parche.

FIG. 1 - Secuencias Peptídicas, Humano, Ratón y Rata Fig.

2. Secuencias Genéricas, Humano, Ratón y Rata FIG.

5. Inhibición de la Fosforilación de L-TAT-IB por JNKs Recombinantes