INHIBICIÓN DE TOXINAS DEL CÓLERA POR GALACTOOLIGOSACÁRIDOS (GOS).

Composición que comprende galactooligosacáridos (GOS), en la que las especies de GOS que tienen un grado de polimerización de 5 o superior,

preferentemente 6 o superior, están presentes en una cantidad, como mínimo, de 35% (% en peso), en base al peso total en seco de todas las especies de GOS presentes en la composición, y en la que el contenido de GOS pentasacáridos y/o hexasacáridos es del 2-100% en peso en base al peso total de la composición

Inhibición de toxinas del cólera por galactooligosacáridos (GOS)

La invención se refiere a composiciones nutricionales y farmacéuticas que comprenden galactooligosacáridos (GOS) no digeribles y a las utilizaciones de las mismas. En particular, se refiere a la utilización de especies de GOS en la prevención, reducción o, en cualquier caso, tratamiento de una enfermedad causada por toxinas bacterianas.

La infección intestinal con la toxina de Vibrio cholerae ha aquejado al mundo desarrollado durante casi 200 años. La Vibrio cholerae se transmite a través de la vía fecal-oral, la forma más habitual mediante el consumo de agua contaminada y en menor grado los alimentos (W.H.O. Cholera (Cólera) , 2004. Wkly Epidemiol Rec 2005; 80 (31) : 261-8) . En individuos inmunocomprometidos y mal nutridos, las Vibrios sobreviven a través de la barrera gástrica y finalmente colonizan el intestino delgado (Tamplin y otros, Appl Environ Microbiol 1990; 56 (6) : 1977-80) . Los brotes recientes de cólera como consecuencia del tsunami asiático y el huracán Katrina en los Estados Unidos, ilustran adicionalmente la importancia del tratamiento de la enfermedad.

Sin embargo, no existen medidas profilácticas contra la toxina del cólera y sin tratamiento las tasas de mortalidad pueden alcanzar el 30-50%. Se ha conseguido un éxito limitado utilizando dos tipos de Vacunas Orales para Cólera (OCV) , aunque no son efectivas contra la cepa Vibrio cholerae 0139. Además, el descubrimiento de que las cepas de Vibrio cholerae productoras de toxinas poseen resistencia a múltiples fármacos tiene implicaciones significativas en la utilización de anticuerpos como tratamiento y estrategia de control. Claramente, existe cierta urgencia por desarrollar tecnologías alternativas para combatir el cólera y enfermedades relacionadas.

Existen muchas toxinas bacterianas que se unen a gangliósido, un glicoesfingolípido ácido, como receptor en la superficie celular de células diana e invaden células diana mediante la posterior internalización del complejo toxina-receptor. La más conocida de éstas es la toxina del cólera (Ctx) , una enterotoxina producida por Vibrio cholerae, y se identificó su receptor específico de la superficie celular como monosialogangliósido gal (beta1-3) galNAc (betal-4) [ (alfa2-3) ]gal (beta1-4) glc (beta) 1-ceramida (GM1) del ácido siálico].

La toxina del cólera es un ensamblaje hexamérico AB5 que consiste en una estructura anular de cinco subunidades B idénticas (Ctx-B) y una subunidad A (Ctx-A) . Como con muchas otras toxinas bacterianas, la actividad catalítica reside en Ctx-A, mientras que la unión al receptor y la liberación de la toxina a la célula diana están mediadas por el pentámero Ctx-B. La unión de las subunidades B a la membrana GM1 se cree que induce un cambio conformacional en la toxina, dando lugar a la entrada del ensamblaje hexamérico que comprende la subunidad A tóxica en la célula diana.

La subunidad A muestra actividad de ADP ribosiltransferasa hacia Gαs, que es un miembro del grupo de proteínas que hidrolizan GTP, responsable de la regulación de muchos aspectos de la función celular (Shah BH. Exp Mol Med 1999; 31 (2) :89-94) . Gαs regula la actividad de adenilato ciclasa y determina la concentración de cGMP en la célula huésped. A continuación, la subunidad A ribosila con ADP la subunidad alfa de Gs, eliminando la actividad innata de GTPasa. Consecuentemente, el estímulo no se puede suprimir y, de este modo, la adenilato ciclasa continúa produciendo cAMP, manteniendo la cascada activa.

Normalmente, en ausencia de Ctx, un mecanismo de activación-desactivación asegura que la Gαs se active según se requiera por la célula en respuesta a la estimulación de la adenilato ciclasa intestinal. Por lo tanto, normalmente, este sistema mantiene la concentración de cGMP lo suficientemente elevada para realizar su función (Faruque y otros, Mol Biol Rev 1998; 62 (4) :1301-14) . La ribosilación incontrolada con ADP de Gαs da lugar a un incremento continuo en la actividad de adenilato ciclasa que finalmente provoca que se acumulen niveles elevados de cGMP. En los intestinos, los niveles de cGMP afectan a los transportadores de sodio y cloruro, provocando un desequilibrio iónico y la alteración del potencial osmótico de membrana. El eflujo masivo resultante de iones cloruro y bicarbonato en el lumen del intestino delgado arrastra grandes cantidades de agua con el mismo mediante ósmosis pasiva.

La clase de toxinas AB5 se pueden subdividir en familias en base a la homología de secuencias y tropismo de los receptores. Tanto la toxina del cólera como las enterotoxinas LT y LT-II de E. coli lábiles al calor están estructuralmente relacionadas. La subunidad B de ambas toxinas presenta una afinidad elevada para la parte de oligosacáridos de un conjunto de glicolípidos, incluyendo GM1. La adherencia de la toxina del cólera o la enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli a GM1 presente en la superficie de células epiteliales que recubren el intestino es la primera etapa de una serie que da lugar a la inducción de diarrea acuosa. Aunque la cólera es más grave, ambas pueden conducir a la muerte como resultado de una deshidratación severa.

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer composiciones que son efectivas en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades asociadas con toxinas bacterianas patogénicas Vibrio cholerae y E. coli Enterotoxigénica. En particular, los presentes inventores exponen la identificación de compuestos que son útiles como inhibidores de la adhesión de la toxina del cólera a su receptor GM1 con la subyacente idea de que reconociendo la toxina bacteriana se puede solventar la resistencia a los fármacos de la cepa bacteriana.

Sorprendentemente, se descubrió que ciertas fracciones de un preparado de oligosacáridos de grado alimenticio no digerible son inhibidores muy eficientes de la unión de Ctx-B a su preceptor natural. De manera más específica, se encontró que las fracciones enriquecidas en galactooligosacáridos (GOS) con un grado de polimerización de cinco o superior, que comprenden GOS pentasacáridos (también referidos en la presente invención como DP5) y GOS hexasacáridos (DP6) , eran adhesivos anti-Ctx-B efectivas al evitar la unión de Ctx a GM1 en una célula diana.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición que comprende galactooligosacáridos (GOS) , en la que las especies de GOS que tienen un grado de polimerización de 5 o superior, preferentemente de 6 o superior, están presentes en una cantidad, como mínimo, del 35% en peso (%p) , en base al peso total en seco de todas las especies de GOS presentes en la composición y en la que el contenido de GOS pentasacáridos y/o hexasacáridos es del 2-100% en peso en base al peso total de la composición. También se da a conocer la utilización de dicha composición de GOS para la fabricación de una composición nutricional o farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad aguda o crónica asociada con la adhesión y/o captación de un miembro de la familia de toxinas del cólera o causada por las mismas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de fraccionamiento para el aislamiento de una fracción de GOS que tiene actividad inhibidora de Ctx a partir de una mezcla de GOS. También se da a conocer una fracción de GOS obtenible mediante dicho método y la utilización de dicha fracción como adhesivo anti-Ctx-B.

También se da a conocer una composición, por ejemplo una composición farmacéutica o nutricional o un concentrado de la misma, que comprende una cantidad elevada de especies GOS DP5 y/o DP6.

Los GOS pertenecen al grupo de carbohidratos no digeribles que se pueden considerar como fibras alimenticias solubles porque se adaptan a la definición generalmente aceptada de fibra alimenticia, que incluye el criterio tanto bioquímico como nutricional/fisiológico (Food Industr y ad hoc Working Group on Dietar y Fibre (Grupo de Trabajo sobre la Fibra Alimenticia apropiado para la Industria Alimenticia (1994) Int. Food Ingred., 1, 46-49) . Los GOS han generado un interés creciente porque pueden inducir la proliferación de bifidobacteria y ácido láctico bacteriano en el intestino humano y, de este modo, mejoran la salud humana. Los GOS no se caracterizan únicamente como prebióticos que mejoran la salud intestinal, sino que también demostraron que reducían el riesgo de cáncer de colon. La posible actividad antitumoral de GOS podría justificarse por la posible... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende galactooligosacáridos (GOS) , en la que las especies de GOS que tienen un grado de polimerización de 5 o superior, preferentemente 6 o superior, están presentes en una cantidad, como mínimo, de 35% (% en peso) , en base al peso total en seco de todas las especies de GOS presentes en la composición, y en la que el contenido de GOS pentasacáridos y/o hexasacáridos es del 2-100% en peso en base al peso total de la composición.

2. Composición, según la reivindicación 1, que comprende especies de GOS que comprenden residuos galactosilo unidos en β, en particular β (1-4) y/o β (1-6)

3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en la que todas las especies de GOS presentes en la composición forman, como mínimo, el 50% en peso, preferentemente, como mínimo, el 60% en peso, más preferentemente, como mínimo, el 70% en peso en base al peso en seco de la composición.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende GOS que tienen un grado de polimerización de 5 en una cantidad, como mínimo, del 40% en peso en base al peso en seco de la composición.

5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende GOS que tienen un grado de polimerización de 6 o superior en una cantidad, como mínimo, del 10% en peso, en base al peso en seco de la composición.

6. Composición que comprende galactooligosacáridos (GOS) , entre los que las especies de GOS que tienen un grado de polimerización de 5 o más están presentes en exceso sobre las especies de GOS que tienen un grado de polimerización inferior a 5, en base al peso en seco de dichas especies de GOS en la composición, y en la que el contenido de GOS pentasacáridos y/o hexasacáridos es del 2-100% en peso en base al peso total de la composición.

7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha composición está esencialmente libre de mono y/o disacáridos, en particular galactosa y/o glucosa y/o lactosa.

8. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende, como mínimo, el 15% en peso de especies de GOS que tienen un grado de polimerización de 6 en base al peso total en seco de todas las especies de GOS presentes en la composición.

9. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además oligosacáridos sialilados no digeribles (SOS) de grado alimenticio, preferentemente SOS derivados de la leche, tales como 3'-sialillactosa.

10. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un alimento o una bebida que comprende de, aproximadamente, 1 mg a, aproximadamente, 20 g de GOS hexasacáridos por parte utilizada.

11. Método para proporcionar una fracción de GOS capaz de inhibir la unión de la toxina del cólera (Ctx) a GM1, comprendiendo dicho método las etapas de:

- proporcionar una mezcla de galactooligosacáridos (GOS) que tienen diferentes grados de polimerización; - opcionalmente extraer la lactosa libre de dicha mezcla de GOS;

- aplicar dicha mezcla de GOS (libre de lactosa) a una resina de intercambio catiónico;

- eluir por etapas los GOS con un grado creciente de polimerización utilizan una fase móvil acuosa y recoger las fracciones de eluyente separadas;

- analizar cada fracción de eluyente por el efecto inhibidor en la unión de Ctx a GM1; y

- seleccionar una o más fracciones capaces de inhibir la unión de Ctx a GM1.

12. Método, según la reivindicación 11, en el que proporcionar dicha mezcla de GOS con diferentes grados de polimerización comprende someter el permeado del suero o la lactosa a una transgalactosidación enzimática utilizando β-galactosidasa.

13. Método, según la reivindicación 11 ó 12, en el que dicha mezcla de GOS que tienen diferentes grados de polimerización comprende una mezcla comercial de GOS, preferentemente la mezcla de GOS comercializada bajo el nombre comercial de VivinalGOS®.

14. Utilización de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la fabricación de una composición nutricional o farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad aguda o crónica asociada con la adhesión y/o captación de un miembro de la familia de las toxinas del cólera o causadas por las mismas.

15. Utilización, según la reivindicación 14, para la fabricación de una composición nutricional o farmacéutica para la

prevención o el tratamiento de una enfermedad aguda o crónica causada por un miembro de la familia de toxinas del cólera, en particular enfermedades diarreicas.

16. Utilización, según la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho miembro de la familia de toxinas del cólera es la toxina del cólera V. cholerae (Ctx-B) o la enterotoxina lábil al calor (LT-B) de E. coli enterotoxigénica (ETEC) .

17. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que la dosis diaria de GOS pentasacáridos y/o hexasacáridos es de hasta, aproximadamente, 250 mg.