Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC.

Composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,

en laque:

a. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ IDNO: 144); o

b. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ IDNO: 190); o

c. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ IDNO: 448); o

d. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ IDNO: 494).

Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC

Campo técnico

La invención se refiere al campo del transporte de iones en las vías respiratorias mediado por ENaC y a composiciones y a métodos para modular la expresión de alfa-ENaC, y más particularmente a la regulación por disminución de alfa-ENaC por oligonucleótidos a través de interferencia por ARN que se administran localmente a los pulmones y el conducto nasal a través de inhalación/administración intranasal, o se administran sistémicamente, por ejemplo mediante inyección intravenosa.

Antecedentes La interferencia por ARN o “iARN” es un término acuñado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observación de que ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391: 806-811, 1998) . El ARNbc corto dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función génica. Esta tecnología se ha revisado numerosas veces recientemente, véanse, por ejemplo Novina, C.D:, y Sharp, P., Nature 2004, 430:161, y Sandy, P., et al., Biotechniques 2005, 39:215.

Las superficies mucosas en la superficie de contacto entre el entorno y el cuerpo han hecho evolucionar varios mecanismos protectores. Una forma principal de tal defensa innata es limpiar estas superficies con líquido. Normalmente, la cantidad de la capa de líquido en una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secreción líquida epitelial, que a menudo refleja la secreción de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraión catiónico) y la absorción de líquido epitelial, que a menudo refleja la absorción de Na+, acoplada con agua y contraanión (Cl- y/o HCO3-) . Muchas enfermedades de las superficies mucosas están provocadas por demasiado poco líquido protector en esas superficies mucosas creado por un desequilibrio entre la secreción (demasiado poca) y la absorción (relativamente demasiada) . Los procesos de transporte salino defectuosos que caracterizan estas disfunciones mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa de líquido protector en las superficies mucosas es “reequilibrar” el sistema bloqueando la absorción de líquido mediada por el canal de Na+. La proteína epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorción de Na+ y líquido es el canal de Na+ epitelial (ENaC) . Alfa-ENaC está situado en la superficie apical del epitelio, es decir, la superficie de contacto entre superficie mucosa-entorno. La inhibición de la absorción de líquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede obtener utilidad terapéutica. Por tanto, existe la necesidad del desarrollo de terapias eficaces para el tratamiento y la prevención de enfermedades o trastornos en los que está implicado alfa-ENaC, por ejemplo fibrosis quística en seres humanos y animales, y particularmente para terapias con alta eficacia. Un requisito previo para la alta eficacia es que el principio activo no se degrade demasiado rápido en un entorno fisiológico.

Li Tianbo et al. describen cómo la interferencia por ARN de alfa-ENaC inhibe la absorción de fluidos de pulmón de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649-L660, 2006.

Sumario En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en la que:

a. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ ID NO: 144) ; o

b. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ ID NO: 190) ; o

c. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ ID NO: 448) ; o

d. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ ID NO: 494) .

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en la que el agente de ARNi comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,

en la que la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 143) , ND8379 (SEQ ID NO: 189) y ND8572 (SEQ ID NO: 447) y ND8595 (SEQ ID NO: 493) , y

en la que la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 144) , ND8379 (SEQ ID NO: 190) y ND8572 (SEQ ID NO: 448) y ND8595 (SEQ ID NO: 494) ,

comprendiendo además la composición un ligando de receptor epitelial.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi, tal como se describió anteriormente en el presente documento, para su uso en terapia.

Las composiciones de la invención, por ejemplo, las composiciones de agente de ARNi pueden usarse con cualquier dosificación y/o formulación descritas en el presente documento, así como con cualquier vía de administración descrita en el presente documento.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de esta descripción, los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

En las figuras:

Figura 1: Mapa de digestos de restricción del constructo pXoon para α-EnaC de macaco clonado.

Figura 2: Secuencia de proteína y de ADN de alfa-EnaC de macaco.

Figura 3: Clonación de los sitios de reconocimiento inespecíficos y específicos predichos en el constructo indicador de luciferasa doble AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nt del sitio diana predicho y 10 nt de secuencia flanqueante en ambos extremos 5’ y 3’.

Descripción detallada Para facilidad de exposición, el término “nucleótido” o “ribonucleótido” se usa a veces en el presente documento en referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente de ARN. Se entenderá que la utilización del término “ribonucleótido” o “nucleótido” en el presente documento también puede referirse, en el caso de un ARN modificado o sustituto de nucleótido, a un nucleótido modificado, o resto de reemplazo sustituto, tal como se describe adicionalmente a continuación, en una o más posiciones.

Un “agente de ARN” tal como se usa en el presente documento, es un ARN no modificado, ARN modificado, o sustituto de nucleósido, cada uno de los cuales se describen en el presente documento o se conocen bien en la técnica de síntesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleósido, los ejemplos preferidos incluyen los que tienen mayor resistencia a la degradación por nucleasas que la que tienen los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen los que tienen una modificación con azúcar en 2’, una modificación en una proyección monocatenaria, preferiblemente una proyección monocatenaria en 3’, o, particularmente si es monocatenario, una modificación en 5’ que incluye uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato.

Un “agente de ARNi” (abreviatura para “agente de ARN interferente”) tal como se usa en el presente documento, es un agente de ARN, que puede regular por disminución la expresión de un gen diana, por ejemplo el gen de ENaC SCNN1A. Aunque no se desea limitarse por la teoría, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de varios mecanismos, incluyendo la escisión postranscripcional de un ARNm diana denominado a veces en la técnica iARN, o mecanismos pretranscripcionales o pretraduccionales.

Un “agente de ARNi bc” (abreviatura para “agente de ARNi bicatenario”) , tal como se usa en el presente documento, es un agente de ARNi que incluye más de una, y preferiblemente dos, hebras en las que la hibridación intercatenaria puede formar una región... [Seguir leyendo]

1.Composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en la que:

a. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ ID NO: 144) ; o

b. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ ID NO: 190) ; o

c. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ ID NO: 448) ; o

d. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ ID NO: 494) .

2.Composición según la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido tiene 30 nucleótidos o menos de longitud, y en la que la hebra sentido y la hebra antisentido forman una región de dúplex de 15 a 30 pares de nucleótidos de longitud.

3.Composición según la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido y la hebra sentido tienen cada una de 19 a 23 nucleótidos de longitud.

4.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una modificación que hace que el agente de ARNi tenga una estabilidad aumentada en una muestra biológica.

5.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleótido modificado en 2’.

6.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende:

al menos un dinucleótido de 5’-uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’) , en el que la uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’) , en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-citidina-adenina-3’ (5’-ca-3’) , en el que la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’; o al menos un dinucleótido de 5’-uridina-uridina-3’ (5’-uu-3’) , en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’.

7.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una modificación en 2’ seleccionada del grupo que consiste en: 2’-desoxi, 2’-desoxi-2’-fluoro, 2’-O-metilo, 2’-O-metoxietilo (2’-O-MOE) , 2’-Oaminopropilo (2’-O-AP) , 2’-O-dimetilaminoetilo (2’-O-DMAOE) , 2’-O-dimetilaminopropilo (2’-O-DMAP) , 2’-Odimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) y 2’-O-N-metilacetamido (2’-O-NMA) .

8.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende un extremo romo.

9.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una proyección de nucleótidos que tiene de 1 a 4 nucleótidos desapareados.

10. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una proyección de nucleótidos en el extremo 3’ de la hebra antisentido del agente de ARNi.

11. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8356 (SEQ ID NO: 143 y 144) .

12. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8379 (SEQ ID NO: 189 y 190) .

13. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8572 (SEQ ID NO: 447 y 448) .

14. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8595 (SEQ ID NO: 493 y 494) .

15. Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi se liga a uno o más de compuesto de

diagnóstico, grupo indicador, agente de reticulación, resto que confiere resistencia a nucleasas, base nitrogenada natural o poco común, molécula lipófila, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecogenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado con epifriedelanol, vitamina, hidrato de carbono, dextrano, pululano, quitina, quitosano, hidrato de carbono sintético, pentadecámero de oligo-lactato, polímero natural, polímero de peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de unión a proteína, molécula de selección como diana de integrina, molécula policatiónica, péptido, poliamina, peptidomimético y/o transferrina.

16. Composición que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en la que el agente de ARNi comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,

en la que la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 143) , ND8379 (SEQ ID NO: 189) y ND8572 (SEQ ID NO: 447) y ND8595 (SEQ ID NO: 493) y

en la que la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 144) , ND8379 (SEQ ID NO: 190) , ND8572 (SEQ ID NO: 448) y ND8595 (SEQ ID NO: 494) y,

comprendiendo además la composición un ligando de receptor epitelial.

17. Composición según la reivindicación 16, en la que el ligando de receptor epitelial es (i) transferrina o (ii) ácido fólico.

18. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 16, para su uso en terapia.

19. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfunción del canal de sodio epitelial seleccionada del grupo de: fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , asma, infecciones de las vías respiratorias, carcinoma de pulmón, síndrome de Liddle, hipertensión, insuficiencia renal y desequilibrio hidroelectrolítico.