Métodos para la identificación de microorganismos usando espectrometría de masas.

Un método para identificar microorganismos de una muestra de sangre,

que comprende:

(a) obtener una muestra de sangre de la que se sabe que contiene o puede contener microorganismos;

(b) lisar y solubilizar selectivamente células no microorganismo en dicha muestra de sangre con una disolución de lisis para producir una muestra lisada, disolución de lisis que tiene un pH de 8 a 13;

(c) poner una capa de dicha muestra lisada sobre un lecho amortiguador de densidad que tiene una densidad homogénea de 1,025 a 1,120 g/ml en un recipiente y centrifugar el recipiente para separar dichos microorganismos de otros componentes de dicha muestra lisada, microorganismos que atraviesan dicho lecho amortiguador de densidad para formar un sedimento de dichos microorganismos en el fondo de dicho recipiente;

(d) examinar dicho sedimento de dichos microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas de dichos microorganismos: y

(e) identificar dichos microorganismos en dicho sedimento de muestra aislado por comparación del espectro de masas medido con espectros de masas de referencia y/o con las masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos, en donde dichos microorganismos son identificados a nivel de familia, nivel de género, nivel de especie y/o nivel de cepa.

Métodos para la identificación de microorganismos usando espectrometría de masas Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para identificar microorganismos en una muestra de sangre. En particular, la presente invención es un método dirigido para la rápida identificación de un microorganismo usando espectrometría de masas.

Antecedentes de la invención La detección de microorganismos patógenos en fluidos biológicos se debería llevar a cabo en el menor tiempo posible, en particular en el caso de una septicemia, para la cual la mortalidad sigue siendo elevada a pesar de la gran variedad de antibióticos de que disponen los médicos. La presencia de agentes biológicamente activos, tal como un microorganismo, en un fluido corporal de un paciente, especialmente en la sangre, se determina generalmente usando frascos para cultivo de sangre. Las infecciones en la corriente sanguínea se asocian con una morbilidad y una mortalidad elevadas; sin embargo, puede llevar varios días la realización de los métodos de diagnóstico actuales, de cultivo seguidos de una prueba de identificación bioquímica y de susceptibilidad a antibióticos. Típicamente, se inicia una terapia empírica basándose en síntomas clínicos, y los resultados de los ensayos sólo afectan a las decisiones clínicas cuando falla la terapia inicial. La capacidad para caracterizar infecciones en la corriente sanguínea en las primeras pocas horas, preferiblemente en una hora después de un resultado positivo en el cultivo de sangre, impulsaría significativamente la relevancia clínica de la información diagnóstica proporcionada. Se han propuesto métodos de multiplicación molecular para satisfacer esta necesidad, pero sigue habiendo importantes desafíos a este planteamiento. El propio caldo de cultivo sanguíneo positivo representa una población naturalmente multiplicada de microorganismos con potencial para uso en una diversidad de rápidas pruebas de identificación (ID) .

Las pruebas de ID fenotípicas automatizadas tradicionales, tales como los sistemas Vitek®, Phoenix y Microscan®, o las pruebas fenotípicas manuales tales como API, para que proporcionen unos resultados fiables, requieren que los microorganismos estén en una fase de crecimiento apropiada y exentos de medios y productos sanguíneos que interfieran. En estos sistemas se emplean colonias desarrolladas a partir del caldo positivo durante 18-24 horas en medios para cultivo en placa. Sin embargo, en un esfuerzo para obtener resultados más rápidamente, algunos laboratorios han comunicado la utilización de estos sistemas con microorganismos aislados de frascos de cultivo sanguíneo positivo. Estas pruebas "directamente desde el frasco" no son apropiadas para todos los microorganismos (por ejemplo, para cocos Gram positivos) y no están validadas por los fabricantes de las pruebas, y generalmente lleva 3-8 horas la obtención de resultados. Se necesitan urgentemente pruebas más rápidas y de mayor especificidad con objeto de proporcionar al médico unos resultados clínicamente relevantes en las primeras pocas horas, preferiblemente en una hora después de un resultado de cultivo positivo.

Los métodos espectrométricos de masas presentan el potencial de permitir la identificación de microorganismos muy rápidamente, pero se pueden encontrar con la interferencia de los muchos compuestos presentes en medios líquidos para cultivo microbiológico y en muestras clínicas tales como sangre, o en combinaciones de los mismos. Los métodos más comúnmente empleados para recuperar directamente microorganismos de un caldo de cultivo sanguíneo positivo son la centrifugación diferencial en dos operaciones y la centrifugación en un tubo para separación de suero.

Otros métodos que se han descrito para la separación e identificación de microorganismos incluyen:

En la Patente de EE.UU. nº 6.177.266 se describe un método para la clasificación quimiotaxonómica de bacterias con biomarcadores específicos de género, especie y cepa generados mediante el análisis de extractos proteicos celulares o células completas por espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS; del inglés, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometr y ) .

En la Patente de EE.UU. nº 7.070.739 y el Documento WO 02/21108 se presenta un método para extraer, separar y purificar microbios, incluyendo virus, mediante la ultracentrifugación bidimensional directa de fluidos corporales o tejido homogeneizado. En una primera operación de centrifugación, se separan todas las partículas que tienen una velocidad de sedimentación superior a la de los microbios que se van a identificar. En la segunda operación de ultracentrifugación, se utiliza la formación de bandas isopícnicas en líquidos preparados para formar un gradiente de densidades de amplio alcance, usando tubos de centrífuga dentados especiales. De acuerdo con la patente, se puede utilizar la técnica de separación para detectar partículas dispuestas en bandas mediante dispersión lumínica o fluorescencia usando colorantes específicos de ácidos nucleicos, y para recuperar las partículas dispuestas en bandas en volúmenes muy pequeños para la caracterización de subunidades proteicas víricas y partículas víricas intactas mediante espectrometría de masas, y para la determinación tanto de la masa del ácido nucleico como de las masas de los fragmentos producidos por enzimas de restricción mediante citometría de flujo por fluorescencia.

En la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. nº 2007/0175278 se describe la utilización de un medio de 2

cultivo líquido para cultivar una muestra de interés, que incluye, por ejemplo, sangre, orina, heces, catéteres intravenosos, etcétera, líneas de producción industriales, sistemas de agua, un producto alimenticio, un producto cosmético, un producto farmacéutico y una muestra forense. Posteriormente, los microorganismos pueden ser recogidos del medio líquido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por centrifugación. Los microorganismos concentrados pueden ser luego transferidos a un material de soporte, opcionalmente después de un secado, para obtener un espectro de vibración. En la solicitud de patente se discuten diversos métodos para identificar y clasificar microorganismos, incluyendo la espectroscopía de vibración, tal como la espectroscopía Raman.

Sin embargo, estos métodos presentan varios inconvenientes cuando se intenta separar y caracterizar microorganismos de muestras complejas tales como medios de cultivo que contienen sangre. Las preparaciones microbianas resultantes contienen a menudo glóbulos rojos, plaquetas, partículas lipídicas, enzimas plasmáticas y fragmentos celulares contaminantes, que pueden causar malos resultados. Estos métodos son también muy laboriosos e inseguros para el usuario a causa de operaciones que pueden dar lugar a una exposición a agentes patógenos potencialmente peligrosos en forma de aerosol. Se necesitan métodos sencillos, seguros y fiables para aislar microorganismos de caldos para cultivo de sangre y otras muestras complejas, que estén exentos de estos materiales que interfieren y sean compatibles con tecnologías de identificación rápida.

En la Patente de EE.UU. nº 4.212.948 se describe un método para analizar una muestra de sangre, que implica depositar una muestra de sangre lisada sobre un agente amortiguador líquido, atóxico, hidrófobo, inmiscible con agua y de alta densidad.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método para identificar microorganismos en una muestra de sangre. El método permite la identificación de microorganismos más rápidamente que las técnicas previas, lo que da lugar a diagnósticos más rápidos (por ejemplo, en un sujeto que tiene, o del que se sospecha que tiene, septicemia) , y la identificación de materiales contaminados (por ejemplo, productos alimenticios y productos farmacéuticos) . Las operaciones implicadas en el método de la invención, de obtención de una muestra de sangre para la identificación de microorganismos, pueden ser llevadas a cabo en un periodo de tiempo muy corto para producir una información procesable clínicamente relevante, por ejemplo, en menos de aproximadamente 120 minutos.

La presente invención se dirige a un método para identificar microorganismos de una muestra de sangre, que comprende:

(a) obtener una muestra de sangre de la que se sabe que contiene o puede contener microorganismos;

(b) lisar y solubilizar selectivamente células no microorganismo en dicha muestra de sangre con una disolución de lisis para producir una muestra lisada, disolución... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar microorganismos de una muestra de sangre, que comprende:

(a) obtener una muestra de sangre de la que se sabe que contiene o puede contener microorganismos;

(b) lisar y solubilizar selectivamente células no microorganismo en dicha muestra de sangre con una disolución de lisis para producir una muestra lisada, disolución de lisis que tiene un pH de 8 a 13;

(c) poner una capa de dicha muestra lisada sobre un lecho amortiguador de densidad que tiene una densidad homogénea de 1, 025 a 1, 120 g/ml en un recipiente y centrifugar el recipiente para separar dichos microorganismos de otros componentes de dicha muestra lisada, microorganismos que atraviesan dicho lecho amortiguador de densidad para formar un sedimento de dichos microorganismos en el fondo de dicho recipiente;

(d) examinar dicho sedimento de dichos microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas de dichos microorganismos: y

(e) identificar dichos microorganismos en dicho sedimento de muestra aislado por comparación del espectro de masas medido con espectros de masas de referencia y/o con las masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos, en donde dichos microorganismos son identificados a nivel de familia, nivel de género, nivel de especie y/o nivel de cepa.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha muestra de sangre procede de un cultivo de sangre.

3. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde al menos una porción de dicho sedimento de dichos microorganismos de la operación (c) es recuperada y puesta sobre un sustrato de soporte antes de dicha operación

(d) de examen.

4. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha espectrometría de masas es seleccionada del grupo que consiste en espectrometría de masas MALDI-TOF, espectrometría de masas con ionización por desorción y electropulverización (DESI) , espectrometría de masas acoplada a cromatografía en fase gaseosa, espectrometría de masas acoplada a cromatografía en fase líquida, espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI) , y espectrometría con tubo de flujo y iones seleccionados (SIFT) .

5. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha identificación comprende además la caracterización de dichos microorganismos basándose en una o más características fenotípicas y/o morfológicas.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha identificación comprende además la caracterización de dichos microorganismos en uno o más modelos de clasificación seleccionados del grupo que consiste en Grupos Gram, Grupos Gram Clínicos, Grupos Terapéuticos y Grupos Funcionales.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha operación (b) de lisis selectiva se lleva a cabo utilizando una disolución de lisis que comprende uno o más detergentes, en donde dicho uno o más detergentes es preferiblemente Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve 200, Brij® 96/97, CHAPS, octil-ß-D-glucopiranósido, saponina, nonaetilenglicol-monododecil-éter (C12E9, polidocanol) , dodecilsulfato sódico, N-laurilsarcosina, desoxicolato sódico, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaína-14, C7BzO, Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201) , anfipoles (PMAL-C8) , metil-ßciclodextrina, o un detergente de polioxietileno que comprende la estructura C12-18/E9-10.

8. El método de la Reivindicación 7, en donde dicha disolución de lisis comprende además una o más enzimas, comprendiendo dichas una o más enzimas una mezcla de una o más proteinasas y una o más nucleasas, y/o uno o más agentes de tamponamiento.

9. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicho lecho amortiguador de densidad comprende uno o más de entre sílice coloidal, agentes de contraste yodados, sacarosa, aceite de inmersión para microscopio, aceite mineral, aceite de silicona, aceite de fluorosilicona, gel de silicona, metrizoato-Ficoll®, diatrizoato-dextrano, carboximetil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, poli (óxido de etileno) (alto peso molecular) , Pluronic® F127, Pluronic® F68, poli (ácido acrílico) , poli (alcohol vinílico) reticulado, polivinilpirrolidina reticulada, metacrilato de PEGmetil-éter, pectina, agarosa, xantano, gellan, Phytagel®, sorbitol, Ficoll®, glicerol, dextrano, glucógeno, cloruro de cesio, fluidos perfluorocarbonados, fluidos hidrofluorocarbonados, y combinaciones de los mismos.

10. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha muestra de sangre es una muestra de cultivo de sangre de la que se sabe que contiene microorganismos.