HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 para el pronóstico de trastornos neurológicos.

Un método de pronóstico in vitro del estado de progresión de trastornos neurológicos o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos,

de un paciente, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de líquido cefalorraquídeo o una muestra de suero o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenidas de dicho paciente, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan con anticuerpos específicos para HMGB1; y

b) cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1), contenida en dicha muestra de líquido cefalorraquídeo, dicha muestra de suero, o tanto dicha muestra de suero como dicha muestra de líquido cefalorraquídeo.

donde cuanto mayor sea el nivel de los anticuerpos específicos para HMGB1 mayor será el riesgo de desarrollar trastornos neurológicos o de desarrollar un estadio avanzado de trastornos neurológicos.

HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 para el pronóstico de trastornos neurológicos Antecedentes de la invención Campo de la invención

La solicitud se refiere a la cuantificaclón de la proteína HMGB1 o de los anticuerpos específicos para HMGB1 en una muestra biológica, en particular suero y Líquido Cefalorraquídeo (LCR) y su correlación respectiva con métodos de pronóstico del estado de progresión de trastornos neurológicos o hacia trastornos neurológicos, en particular trastornos neurológicos asociados con la infección por VIH y con métodos de diagnóstico. La solicitud también divulga la correlación de la proteína HMGB1 o de los anticuerpos específicos para HMGB1 con la supervisión de la Infección por VIH o con la carga viral así como métodos de pronóstico del estado de progresión del SIDA y trastornos neurológicos asociados con SIDA.

Descripción de la técnica relacionada

Poco después de la Infección, el VIH-1 es capaz de penetrar en el cerebro, dando como resultado con el tiempo complicaciones asociadas con VIH en el sistema nervioso central (SNC). La demencia asociada con VIH (HAD) está caracterizada clínicamente por disfunciones motoras y conductuales que conducen a ataques, coma y muerte en un periodo de 6 meses después de la aparición. La encefalitis por VIH, el correlacionado patológico de HAD, se caracteriza por astrogliosis generaliza, tensión oxidativa, desregulación de citocinas/quimiocinas y degeneración neuronal (Gonzalez-Scarano y Martin-Garcia, Nat Rev Immunol 25, 5: 69-81). Puesto que las neuronas no se ven afectadas por VIH-1, la opinión actual es que estas células se dañan indirectamente por quimiocinas proinflamatorias liberadas por células gllales activadas. IP-1 (CXCL1) es una quimiocina neurotóxica que está regulada positivamente en astroglía y se ha sugerido que potencia la infección por retrovirus y media en la lesión neuronal. Se ha notificado la elevación de IP-1 en LCR en infección por VIH, y su nivel se ha correlacionado con la carga viral de VIH en LCR (Cinque P ef al. J Neuroimmunol 25, 168: 154). También se ha notificado una posible asociación entre los niveles de proteína qulmloatrayente de macrófagos 1 LCR (MCP-1 o CCL2) y el desarrollo de HAD en una cohorte que ha experimentado HAART con Infección por VIH avanzada (Sevigny JJ, Albert SM, McDermott MP; ef al. Neurology. 24; 63: 284). Otro estudio presentó una asociación entre los niveles de MCP-1 en plasma y demencia asociada a VIH (Sevigny ef al. Arch. Neurol. 27, 64: 97).

La proteína de caja de grupo de alta movilidad 1 (HMGB1) es una proteína cromosómica no histona que actúa como una citocina proinflamatoria potente cuando se secreta de forma activa de macrófagos, monocitos, células dendríticas y otras células activadas tales como linfocitos NK. HMGB1 se comporta como un desencadenante de inflamación, atrayendo células inflamatorias y de reparación de tejido, reclutando células madre y promoviendo su proliferación. Además, HMGB1 activa células dendríticas (CD) y promueve su maduración funcional y su respuesta a quimiocinas de ganglios linfáticos. Los leucocitos activados secretan de forma activa HMGB1 en el microambiente. De este modo HMGB1 actúa de una manera autocrina/paracrina y mantiene programas de reparación y defensa a largo plazo (Bianchi y Manfredi, 27; Lotze y Tracey, 25).

En recientes estudios, HMGB1 se ha identificado como biomarcador en enfermedad neurológica, por ejemplo esclerosis múltiple (Andersson ef al., Journal of Leukocyte Biology, 28, 84, 1248-1255) se ha mostrado que HMGB1 desencadena replicación de VIH en CD infectadas por VIH, contribuyendo de este modo a la constitución de depósitos virales en CD (Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 28). Considerando que las CD son las primeras dianas para VIH en las primeras horas de infección de la mucosa, que después migrarán a órganos linfoides secundarios cuando transmitan VIH a linfocitos T, estos hallazgos plantean la cuestión de la implicación in vivo de HMGB1 en el desencadenamiento de la replicación viral y suministro de depósitos virales. Se produjo HMG1 durante una comunicación entre CD infectadas por VIH y linfocitos NK activados, dando como resultado también resistencia de CD infectadas por VIH a muerte por NK. La supervivencia de CD se asoció con la regulación positiva de dos inhibidores de apoptosis, C-IAP2 y c-FLIP en CD infectadas, un proceso inducido por HMGB1 (Melki M-T ef al. PLoS Pathogens 21, 6 (4) e1862). El bloqueo de la actividad de HMGB1 por inhibidores específicos, tales como glicirricina o anticuerpos de bloqueo, anula la replicación de VIH en CD infectadas (Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 28) y restaura la susceptibilidad de CD infectadas a muerte por NK (Melki M-T ef al. PLoS Pathogens 21, 6 (4) e1862). Estos hallazgos, que proporcionan nueva información sobre como el VIH secuestra las CD para promover la diseminación viral y mantener la viabilidad de depósitos a largo plazo, ha sido el objeto de la solicitud de patente PCT/EP29/6828.

Estos hallazgos también plantean la cuestión de la implicación in vivo de HMGB1 en el desencadenamiento de replicación viral y suministro de depósitos virales. Para abordar esta cuestión, se ha cuantificado la concentración de HMGB1 en suero de pacientes infectados por VIH (Elisa, Shino test, IBL) para evaluar la contribución in vivo de HMGB1 en circulación a la carga viral de VIH en plasma y a la evolución de la enfermedad. Además, considerando que pudieron encontrarse autoanticuerpos específicos para HMGB1 en enfermedades autoinmunes tales como SLE (lupus) (Hayashi ef al., 29), se desarrolló un ensayo de Elisa específico para comprobar si se detectaron

anticuerpos específicos anti-HMGB1 en suero de pacientes infectados por VIH en enfermedad de VIH.

Se ha presentado la medida tanto de HMGB1 como de anticuerpos anti-HMGB1 en suero de pacientes en la solicitud de patente PCT/EP29/6828. Se han extraído las siguientes conclusiones:

(i) la infección por VIH crónica desencadena la producción de HMGB1, detectado a niveles aumentados en suero de pacientes infectados, lo que a su vez induce la producción de anticuerpos neutralizantes;

(¡i) se detecta una correlación inversa entre HMGB1 y anticuerpos (Ab) anti-HMGB1, lo que indica que cuando HMGB1 se une a los anticuerpos, este ya no se detecta en muestras de suero;

(i¡¡) cuantos más anticuerpos anti-HMGB1 (lo que quiere decir que se ha producido más HMGB1 anteriormente), menos linfocitos T CD4, lo que sugiere que los niveles aumentados de anticuerpos anti-HMGB1 en suero están asociados con la evolución de la enfermedad; y

(iv) la terapia antirretroviral potente (HAART) reduce los niveles en suero tanto de HMGB1 como de anticuerpos anti-HMGB1 y puede normalizarlos por debajo de los niveles de la línea basal.

La solicitud de patente PCT/EP29/6828 también ha planteado la hipótesis de que cuantos más anticuerpos anti- HMGB1 en suero, menor carga viral en suero. Sin embargo, esta hipótesis no se ha confirmado en un análisis exhaustivo de los experimentos realizados y en una cohorte mayor de pacientes. De hecho, se ha mostrado además que la correlación establecida entre anticuerpos anti-HMGB1 y la carga viral en suero divulgada en la patente PCT/EP29/6828 derivaba de un análisis estadístico indebido de los resultados derivados de una cohorte de pacientes que abarcan tanto pacientes no tratados como pacientes tratados (tratamiento que tiene un efecto en la carga viral).

Descripción de la invención

La solicitud aborda la cuestión de métodos basados en la cuantificación de HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 para supervisar la infección por VIH y en algunos casos para supervisar la carga viral, y la Invención aborda la cuestión de la posible implicación de HMGB1, anticuerpos anti-HMGB1 y quimiocinas en el método de pronóstico de la aparición trastornos neurológicos asociados con el SIDA o infección por VIH y en métodos de diagnóstico en un paciente infectado por VIH. Más en general, la invención se refiere además a métodos de pronóstico del estado de progresión de trastornos neurológicos o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos basándose en la cuantificación de HMGB1, anticuerpos anti HMGB1, y opcionalmente quimiocinas y a métodos de diagnóstico. Finalmente, la solicitud divulga un método de pronóstico in vitro del estado de progresión de una enfermedad o un trastorno en el que se ha mostrado que HMGB1 está implicado (por ejemplo, en el que el nivel de HMGB1 es mayor que el nivel de HMGB1 en un paciente sano o una población sano), basándose en la cuantificación de anticuerpos anti HMGB1, y opcionalmente quimiocinas.

HMGB1 es una proteína bien conocida que aparece en... [Seguir leyendo]

1. Un método de pronóstico in vitro del estado de progresión de trastornos neurológicos o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos, de un paciente, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de líquido cefalorraquídeo o una muestra de suero o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenidas de dicho paciente, con proteína HMGB1 nativa o derivados de proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan con anticuerpos específicos para HMGB1; y

b) cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad I (HMGB1), contenida en dicha muestra de líquido cefalorraquídeo, dicha muestra de suero, o tanto dicha muestra de suero como dicha muestra de líquido cefalorraquídeo.

donde cuanto mayor sea el nivel de los anticuerpos específicos para HMGB1 mayor será el riesgo de desarrollar trastornos neurológicos o de desarrollar un estadio avanzado de trastornos neurológicos.

2. El método de pronóstico in vitro del estado de progresión de trastornos neurológicos, o el estado de progresión hacia trastornos neurológicos, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además cuantificar la quimiocina IP-1 y/o la quimiocina MCP-1, en dicha muestra, en particular una muestra de suero o una de líquido cefalorraquídeo, o tanto en dicha muestra de suero, como en dicha muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenidas de dicho paciente, donde cuanto mayor sea el nivel de anticuerpos específicos para HMGB1 y mayor la quimiocina IP- 1 y/o la quimiocina MCP-1, mayor será el riesgo de desarrollar trastornos neurológicos o de desarrollar un estadio avanzado de trastornos neurológicos.

3. El método de pronóstico in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde dichos trastornos neurológicos se asocian con una enfermedad o trastorno que se selecciona del grupo que consiste en (1) enfermedades o trastornos de origen infeccioso, por ejemplo, infección bacteriana, infección patógena, infección viral, o infección por prion, tal como infección por VIH; y (2) enfermedades o trastornos cuyo origen no es infeccioso o cuyo origen es desconocido, por ejemplo, lesión neuronal aguda, lesión cerebral traumática, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntlngton, lesión cerebral postisquémica, enfermedad de Parkinson, cualquier trastorno que afecte al sistema nervioso periférico y/o a la médula espinal, tal como lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedades desmlellnlzantes tales como esclerosis múltiple (EM).

4. El método de pronóstico in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende

además:

(a) identificar cambios volumétricos en los ganglios básales de dicho paciente, preferentemente por mediciones de captura de imágenes de resonancia magnética; y/o

(b) identificar cambios metabólicos en los ganglios básales de dicho paciente, preferentemente calculando la relación en suero de Colina/N-acetil Aspartato (Cho/NAA).

5. El método de pronóstico in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dichos trastornos neurológicos se asocian con la infección por VIH en un paciente infectado con VIH.

6. El método de pronóstico in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dichos trastornos neurológicos se asocian con infección por VIH en un paciente infectado con VIH y sometido a terapia retroviral.

7. Un método de diagnóstico in vitro de la presencia de trastornos neurológicos en un paciente, que comprende:

(a) evaluar la presencia o ausencia de trastornos neurológicos por criterios clínicos convencionales; y

(b) cuantificar los anticuerpos específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad 1 (HMGB1) contenida en una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de suero, o tanto una muestra de suero como una muestra de líquido cefalorraquídeo, obtenidas de dicho paciente, después de poner en contacto dicha muestra con proteína HMGB1 nativa o derivados de la proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan con anticuerpos específicos para la HMGB1;

donde el nivel de anticuerpos específicos para HMGB1 se correlaciona con el diagnóstico de la presencia de trastornos neurológicos por criterios clínicos convencionales.

8. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además la cuantlflcaclón de otras moléculas halladas en la muestra tales como quimiocinas, y preferentemente la cuantificaclón de la quimiocina IP-1 y/o la quimiocina MCP-1.

9. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde dichos trastornos neurológicos se asocian con SIDA en un paciente infectado por VIH.

1. El método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende antes de poner en contacto la muestra con la proteína HMGB1 nativa o derivados de la proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan con anticuerpos específicos para HMGB1, una etapa de tratar la muestra por un tratamiento ácido para disociar los complejos inmunitarios hallados en la muestra, preferentemente con Glicina 1,5 M a un pH bajo, y donde en dicho método, los anticuerpos cuantlflcados específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad 1 (HMGB1) son anticuerpos totales específicos para HMGB1.

11. El método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, donde los anticuerpos cualificados específicos para la Caja del Grupo de Alta Movilidad 1 (HMGB1) son la fracción en circulación de dichos anticuerpos (anticuerpos en circulación) o su fracción en complejo ¡nmunológlco.

12. El método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el derivado de proteína HMGB1 se selecciona del grupo que consiste en una HMGB1 recomblnante, una parte inmunológicamente reactiva de HMGB1, una parte inmunológicamente reactiva de HMGB1 cuya secuencia es común a las proteínas HMGB1 de diversos orígenes y la BOXB recomblnante de HMGB1 recomblnante correspondiente a la secuencia común a ser humano y ratón de HMGB1.

13. Uso de un kit para llevar a cabo el pronóstico del estado de progresión de trastornos neurológicos de un paciente, o estado de progresión hacia trastornos neurológicos de un paciente, donde dicho kit comprende:

a) proteína HMGB1 nativa o derivados de la proteína HMGB1 siempre que estos derivados se unan con anticuerpos específicos para la HMGB1;

b) opclonalmente, una solución de disociación áclda que tiene un pH entre 1 y 3, para disociar complejos inmunológicos de HMGB1/anticuerpo anti-HMGB1 hallados en la muestra biológica, cuando se toma del paciente, sin alterarla capacidad de unión del anticuerpo anti-HMGB1;

c) opcionalmente, medios para cuantificar quimiocinas;

d) opcionalmente, un tampón de neutralización;

e) opclonalmente, anticuerpos secundarios que se unen con el complejo de HMGB1/antlcuerpos específicos; y

f) opcionalmente, instrucciones de uso, en particular un prospecto.

14. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicho kit comprende:

a) proteína HMGB1 nativa o derivados de dicha proteína HMGB1; y

b) dicha solución de disociación ácida.

15. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicho kit comprende:

a) proteína HMGB1 nativa o derivados de dicha proteína HMGB1; y

b) medios para cuantificar quimiocinas.

16. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 13 o 15, donde dicha quimiocina es la quimiocina IP-1 y/o la quimiocina MCP-1.