HAPTENOS Y CONJUGADOS DERIVADOS DE PIOCIANINA, ANTICUERPOS DE LOS MISMOS, Y MÉTODO INMUNOQUÍMICO PARA LA DETECCIÓN DE INFECCIONES PROVOCADAS POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA.

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general I y su uso como hapteno.

****IMAGEN****

Es asimismo objeto de la presente invención, un conjugado del compuesto I anterior con una proteína transportadora o fragmento de la misma, con un agente de marcaje detectable, o con un polímero o soporte, así como su uso para la obtención de anticuerpos. Además, la presente invención también hace referencia a un método para la detección y/o cuantificación de 1-hidroxifenazina y/o piocianina que utiliza los anticuerpos y conjugados anteriores para la detección de infecciones provocadas por Pseudomonas aeruginosa.

HAPTENOS y CONJUGADOS DERIVADOS DE PIOCIANINA, ANTIC UERPOS DE LOS MISMOS, Y MÉTODO INMUNOQUiMICO PARA LA DETECCiÓN DE INFECCIONES PROVOCADAS POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se relaciona con compuestos de fórmula general 1, su uso como haptenos, sus conjugados y el uso de los mismos para la obtención de anticuerpos. Asimismo, la invención también se relaciona con un método para la detección y/o cuantificación de piocianina y/o 1-hidroxifenazina que utiliza los anticuerpos y conjugados de la invención para la detección de infecciones provocadas por Pseudomonas aeruginosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las Infecciones Nosocomiales (IN) siguen siendo hoy en día una de las primeras causas de muerte en los países en desarrollo. Se estima que cada año en la Unión Europea (UE) 4 millones de pacientes adquieren una IN y aproximadamente 37000 de ellos mueren como 15 consecuencia directa de la infección. Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo oportunista frecuentemente aislado en las unidades de cuidados intensivos (UCI) , presente en neumonias, fibrosis quistica (FQ) , infecciones del torrente sanguineo y algunas enfermedades inmunosupresoras. La actual falta de herramientas de diagnóstico especificas es la causa de la prescripción de antibióticos de amplío espectro, los cuales matan a una 20 gran parte de las bacterias debido a la ignorancia del verdadero microorganismo responsable de la enfermedad. La formación de biopelículas es una característica importante de P. aeruginosa que contribuye significativamente a la resistencia antimicrobiana y a la cronicidad de estas infecciones (Nature 2000, 407 (6805) , 762-764) . Según el informe del European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) , P. 25 aeruginosa es resistente a piperacilína, ceftazidima, fluoroquinolonas, aminoglucósidos y carbapenems, y la resistencia combinada es común en el 15% de los aislamientos resistentes al menos a tres clases de antibióticos, y un 5% de los aislamientos resistentes a todos los antimicrobianos de las cinco clases bajo vigilancia. Una infección por P. aeruginosa involucra muchos factores de virulencia, tales como proteasas, hemolísinas, 30 exotoxina Ay metabolitos secundarios tales como piocianina (1-metoxi-5-metil fenazina) y 1hidroxifenazina. Se ha informado de que la piocianina está relacionada con las bacterias de detección de quórum (FEMS Microbiol Lelt 2009, 290, 1-9, Molecular Microbiology 2006, 61 (5) , 1308-1321) . Debido a su naturaleza zwitteriónica puede penetrar las membranas celulares y generar especies reactivas de oxígeno en el ciclo redox intracelular, produciendo un amplio daño amplio en las células humanas.

Actualmente, los métodos de identificación de patógenos se basan en el enriquecimiento clásico de cultivo celular seguido de la identificación por medios bioquímicos. Estos métodos 5 consumen tiempo y la detectabilidad lograda a menudo no es suficiente a menos que se empleen largos periodos de enriquecimiento de células de cultivo (mínimo de 24 horas) . Estos tiempos largos de diagnóstico son inaceptables en el caso de una sepsis en la que el paciente puede entrar en shock en un período de 24-48 h. Para mejorar los actuales métodos de detección, se han introducido métodos de PCR que amplifican y secuencian una 10 diana específica de ADN del microorganismo. Los métodos de amplificación de ADN dan importantes conocimientos sobre el genoma de las bacterias, sin embargo, estas técnicas presentan limitaciones considerables relacionadas con la necesidad de ser realizada por personal altamente cualificado, el requisito de la extracción de ADN el cual es un proceso tediosos y requiere etapas de purificación para amplificar los materiales genéticos, y, a 15 pesar de estos esfuerzos, hay grandes dificultades para poner en práctica estos procedimientos como dispositivos que puedan ser adecuados para ejecutarse en pequeños laboratorios locales, evitando la necesidad de transportar las muestras a instalaciones centralizadas. Alternativamente, los métodos de análisis inmunoquímicos, ya bien aplicados en los laboratorios clínicos, han evolucionado hacia dispositivos inmunosensor sofisticados y

eficientes capaces de proporcionar respuestas en tiempo real en presencia de una diana particular en combinación con recientes descubrimientos en principios de la nanobiotecnología y enfocar los beneficios para que puedan satisfacer las necesidades para el campo de diagnóstico clínico.

Con respecto a P. aeruginosa, ciertos autores han seleccionado el pigmento piocianina como un objetivo para mejorar la vigilancia de este patógeno, debido a su especificidad para esta especie. Se han descrito métodos de HPLC para la cuantificación de piocianina y su meta bolito 1-hidroxifenazina en matrices biológicas (Trends in Molecular Medicine 2004, 10 (12) , 599-6069, European Joumal 01 Biochemistr y 1986, 159 (2) , 309-313) , sin embargo, no son adecuados para el diagnóstico clínico ya que se requiere extracciones y procedimientos de purificación que aumentan y complican significativamente el tiempo de análisis. Más recientemente, también se ha publicado un sensor de fibra de carbono para la detección de piocianina (Bioelectrochemistr y 2010, 77 (2) , 114-119) , alcanzando concentraciones tan altas como 130 IJM en la detección de muestras de esputo proveniente de pacientes con Fa. Sin embargo, este método no es completamente específico, ya que otras sustancias redox

reactivas podrían generar señal, debido a la falta de un receptor específico. En cuanto a los métodos inmunoquímicos, altamente específicos y sensibles y que además ofrecen la posibilidad de diferentes formatos de ensayo, no han sido empleados para la detección de infecciones provocadas por Pseudomonas aeruginosa basadas en la detección de piocianina y/o sus metabolitos.

Se han publicado estructuras de tipo fenazinas, como el compuesto ácido 9-hidroxifenazinil2-carboxílico (Chem.Pharm. Bulletin 1959, 7, 88) , así como derivados de piocianina con posible uso como agentes anticancerígenos cuya síntesis describe compuestos intermedios de tipo fenazina (US4845222) pero no se ha descrito su uso como haptenos.

Por tanto, existe una necesidad en el estado de desarrollar metodologías alternativas a las descritas en la técnica para la detección de infecciones provocadas por Pseudomonas aerugjnosa en muestras biológicas, en particular mediante métodos inmunoquímicos COMPENDIO DE LA INVENCiÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un compuesto de fórmula general 1:

§

N

(1)

donde R1 se selecciona entre H y Cl-4 alquilo; RZ se selecciona entre H y (CHz) m-COR4: R3

es (CHz) m-COR4 si RZ es H, o R3 es H si RZ es (CHz) m-COR4 ; R4se selecciona entre H y ORs; RS se selecciona entre H y Cl-4 alquilo m es un número entero seleccionado entre Oy 6:

con la condición que dicho compuesto no es

OH

HOOC

(I-a)

ni tampoco N

~

N

donde R3

R' se selecciona entre H y C, _zalquilo, RZ es (CHZ) '_3COORS, es H y RS se selecciona entre H y CH3 (I-b) ; o R' se selecciona entre H y C, _zalquilo, RZ es H, RJ es (CHz) , _JCOORS y RS se selecciona entre H y eH, (I-e) .

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el uso de al menos un compuesto de fórmula general I como hapteno (en adelante hapteno de la invención) :

N

~

N

(1)

donde R' se selecciona entre H y C1-4 alquilo; R2

se selecciona entre H y (CHz) m-COR4; RJ

es (CHz) m-COR4 si R2 es H, o RJes H si RZ es (CHz) m-COR4;

R4

se selecciona entre H y OR5;

R5

se selecciona entre H y C, -4 alquilo m es un número entero seleccionado entre Oy 6;

En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado, también referido en la presente descripción como conjugado de la invención, que comprende al menos un hapteno de fórmula I (hapteno de la invención) como cualquiera de los definidos anteriormente, y un segundo componente seleccionado del grupo de:

(a) una proteína transportadora o un fragmento de la misma que confiere antigenicidad,

(b) un agente de marcaje detectable, y 10 (c) un polímero o un soporte.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un conjugado según la invención que consiste en crear una unión cava lente entre el hapteno de fórmula I y la proteína, o bien entre el hapteno de fórmula I y el agente de marcaje detectable, bien sea directamente o a través de un grupo de unión.

Aún en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un conjugado...

1. Un compuesto de fórmula general I

OR'

N

(1)

caracterizado por que:

R1 se selecciona entre H y alquilo Cl -4, R2se selecciona entre H y (CH2) m-COR4, R3

es (CH2) m-COR4si R2es H, o R3 es H si R3 es (CH2) m-COR4, R4 se selecciona entre H y OR5,

R5 se selecciona entre H y alquilo Cl -4, m es un número entero seleccionado entre Oy 6,

con la condición de que dicho compuesto no es un compuesto de fórmula general I de los siguientes:

l-a. donde R1 es H, R2es COOH y R3 es H; o I-b. donde R1 es seleccionado entre H y alquilo Cl-2, R2 es seleccionado entre (CH2) 1_3COOH y (CH2) '~3~COOCH3 y R3es H: o l-c. donde R1 es seleccionado entre H y alquilo Cl-2 , R2 es H y R3 es seleccionado entre (CH2) '~3-COOH y (CH2) '~3-COOCH3.

2. Uso de al menos un compuesto de fórmula 1,

N

(1)

donde:

R' se selecciona entre H y alquilo C, -4; R2 se selecciona entre H y (CH2) m-COR4; R3

es (CH, lm-COR' si R' es H, o R3 es H si R3 es (CH, ) m-COR';

R4se selecciona entre H y ORs; RS

se selecciona entre H y alquilo C, -4; y m es un número entero seleccionado entre Oy 6,

o una combinación de los mismos, como hapteno.

3. Conjugado que comprende al menos un hapteno de fórmula general 1,

N

~

, o N

(1)

donde:

R' se selecciona entre H y alquilo C'-4, R2

se selecciona entre H y (CH2) m-COR4, 15 R3 es (CH2) m-COR4 si R2es H, o R3 es H si R3 es (CH2) m-COR4, R4se selecciona entre H y ORs, RS

se selecciona entre H y alquilo C'-4, y m es un número entero seleccionado entre Oy 6;

o una combinación de los mismos, y un segundo componente seleccionado del grupo que 20 consiste en:

a. una proteína transportadora, o un fragmento de la misma, que confiere antigenicidad,

b. un agente de marcaje detectable, y

c. un polímero o un soporte.

4. Conjugado que comprende al menos un hapteno de fórmula 1,

N

(1)

donde:

Rl

se selecciona entre H y alquilo Cl -4,

R2 se selecciona entre H y (CH2) m-COR4, R3

es (CH2) m-COR4 si R2 es H, o R3 es H si R3 es (CH 2) m-COR4,

R4 se selecciona entre H y OR5,

R5 se selecciona entre H y alquilo Cl -4, y m es un número entero seleccionado entre Oy 6;

con la condición de que dicho compuesto no es un compuesto de fórmula general I de los siguientes:

I-a. donde Rl es H, R2 es COOH y R3 es H; o R2

I-b. donde Rl es seleccionado entre H y alquilo Cl •2, es seleccionado entre (CH2) 1_3COOH y (CH' ) '_3·COOCH3 y R3es H: o 15 l-c_ donde Rl es seleccionado entre H y alquilo Cl _2 , R2 es H y RJ es seleccionado entre (CH') , .3·COOH y (CH') , .3·COOCH3,

y un segundo componente seleccionado del grupo que consiste en:

a. una proteína transportadora, o un fragmento de la misma, que confiere antigenicidad,

b. un agente de marcaje detectable. y 20 c. un polimero o un soporte.

5_ Conjugado según la reivindicación 4, que además de dicho hapteno de fórmula I comprende un segundo hapteno de fórmula 1,

N

(1)

donde:

R1

se selecciona entre H y alquilo Cl -4, 5 R2 se selecciona entre H y (CH2) m-COR4, R3

es (CH2) m-COR4 si R2 es H, o R3 es H si R3 es (CH2) m-COR4,

R4 se selecciona entre H y OR5,

R5 se selecciona entre H y alquilo Cl -4, y

m es un número entero seleccionado entre Oy 6.

6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el hapteno de fórmula I comprende una mezcla de ácido 9-hidroxifenazina-2-carboxílico (11) y de ácido 6hidroxifenazina-2-carboxílico (111) .

OH OH

HOoe N

"'"

/

N Hooe 15 ácido 9-hidroxifenazina-2-carboxílico ácido 6-hidroxifenazina-2-carboxílico (11) (111)

7. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que el segundo componente es una proteína transportadora, o un fragmento de la misma que confiere antigenicidad.

8. Conjugado según la reivindicación 7, donde dicha proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en: hemocianina de cangrejo herradura (HCH) y seroalbúmina bovina (BSA) .

9. Método de obtención de un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 caracterizado por que comprende crear una unión covalente, directa o a través de un agente de entrecruzamiento, entre la proteína, o el agente de marcaje detectable, o el polímero, o el soporte, y al menos un hapteno de fórmula general 1,

OR'

N

(1)

donde:

R' se selecciona entre H y alquilo CH , R2

se selecciona entre H y (CH2) m-COR4, R3

es (CH2) m-COR4 si R2 es H, o R3 es H si R3 es (CH2) m-COR4,

R" se selecciona entre H y OR5,

R5

se selecciona entre H y alquilo C'-4, y m es un número entero seleccionado entre Oy 6.

10. Método según la reivindicación 9, donde la unión covalente del hapteno de fórmula I R2

se lleva a cabo a través del grupo - (CH2) m-COR4 del sustituyente ó R3 distinto de hidrógeno.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, donde la unión covalente se lleva a cabo mediante un método de conjugación seleccionado del siguiente grupo: método del anhídrido mixto, método de la carbodiimida y método del éster activo .

12. Uso de un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para la obtención de anticuerpos.

13. Anticuerpo que reconoce específicamente un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, o antisuero que comprende dicho anticuerpo.

14. Anticuerpo O antisuero según la reivindicación 13, donde el anticuerpo se selecciona entre monoclonal y policlonal.

15. Anticuerpo O antisuero según la reivindicación 14, donde el anticuerpo es policlonal.

16. Anticuerpo o antisuero según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde el anticuerpo comprende un agente de marcaje detectable.

17. Método in vitro para detectar y/o cuantificar al menos una fenazina, dicha fenazina seleccionada entre piocianina y/o 1-hidroxifenazina, en una muestra que comprende el uso de un anticuerpo o un antisuero según se define en una cualquiera de las reivindicaciones

a 16.

18. Método según la reivindicación 17 donde, además, se utiliza un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 que, cuando comprende detectar y/o cuantificar piocianina, el método comprende un tratamiento previo de la muestra en condiciones adecuadas de conversión de piocianina a 1-hidroxifenazina mediante agentes quimicos o biológicos adecuados.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde la detección y/o cuantificación se lleva a cabo mediante una técnica inmunoquimica.

21. Método según la reivindicación 20 donde la técnica inmunoquímica es un ELlSA competitivo indirecto.

22. Método según la reivindicación 21 , donde la técnica inmunoquímica comprende las siguientes etapas:

a. inmovilizar un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 en un soporte sólido,

b. eliminar el conjugado no inmovilizado,

c. añadir la muestra a analizar y un primer anticuerpo anti-fenazina definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en el soporte sólido del apartado a. e incubar,

d. eliminar el primer anticuerpo no unido al conjugado,

e. añadir un segundo anticuerpo conjugado con un agente de marcaje detectable, reconociendo dicho segundo anticuerpo al primer anticuerpo e incubar,

f. eliminar el segundo anticuerpo no unido al primer anticuerpo, y

g. detectar y/o cuantificar el complejo obtenido según el apartado e. con una composición que contiene un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente,

23. Método según la reivindicación 22 que, cuando comprende detectar y/o cuantificar

piocianina, previamente al apartado c de puesta en contacto de la muestra con el anticuerpo anti-fenazina, dicho método comprende además

c', tratar la muestra en condiciones adecuadas de conversión de piocianina a 1-hidroxifenazina mediante agentes químicos o biológicos adecuados, en especial medio básico.

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, donde la muestra es procedente de un sujeto susceptible de tener una infección provocada por Pseudomonas aeruginosa.

25. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, donde la muestra es una muestra de esputo,

26. Kit para la detección y/o cuantificación de piocianina y/o 1-hidroxifenazina en una muestra, caracterizado por que comprende al menos un anticuerpo anti-fenazina definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, o un antisuero que comprende dicho anticuerpo, o un conjugado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, o cualquier combinación de los mismos.

27. Kit según la reivindicación 26, que además comprende al menos un anticuerpo contra los anticuerpos anti-fenazina,