Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSb,

ATb, KRb, DHb y ACPb, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518 y 2621-2710 de la SEC ID Nº 3

Genes biosintéticos para la producción de insecticidas de tipo butenilespinosina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona genes biosintéticos de butenilespinosina novedosos, vectores que incorporan los genes biosintéticos, estirpes de Saccharopolyspora transformadas con los genes biosintéticos, métodos de uso de estos genes para aumentar la producción de macrólidos insecticidas de tipo espinosina y métodos de uso de los genes o fragmentos de los mismos para cambiar los metabolitos preparados por estirpes productoras de espinosina de Saccharopolyspora spp.

Antecedentes de la invención

Los compuestos de espinosina producidos de forma natural consisten en un sistema de anillo tricíclico 5,6,5 condensado con una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un aminoazúcar (forosamina) (véase Kirst et al. 1991). Si el aminoazúcar no está presente, los compuestos se han designado como pseudoagliconas, y si el azúcar neutro no está presente, entonces los compuestos se han designado como pseudoagliconas inversas.

Las espinosinas A83543 se producen por la estirpe NRRL 18395 de Saccharopolyspora spinosa y derivados de la misma. Los miembros conocidos de la familia de espinosina A83543 y las estirpes que los producen se han dado a conocer en las patentes de EE.UU. nº 5.362.634, 5.202.242, 5.840.861, 5.539.089 y 5.767.253. Los compuestos se identifican por la referencia de una letra: espinosina A, B, etc. (véase Kirst et al., 1991). Se da la estructura de la espinosina A83543 A en la Tabla 1 a continuación en la presente memoria. Los compuestos de espinosina A83543 son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular las especies de Lepidoptera y Diptera, y tienen perfiles ambientales y toxicológicos favorables.

Se dan a conocer las secuencias de ADN de los genes que codifican las enzimas que dirigen la biosíntesis de la espinosina A83543 en la patente de EE.UU. nº 6.143.526, correspondiente al documento WO99/46387. Los genes clonados y marcos abiertos de lectura se designan como spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre.

Los genes biosintéticos de espinosina, excluyendo aquellos para la biosíntesis de ramnosa, específicamente los genes spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y spnS, están localizados de forma contigua en una región de aproximadamente 74 kb del cromosoma de S. spinosa. Se ha mostrado que los genes spnA, spnB, spnC, spnD y spnE eran similares a los genes responsables de la biosíntesis de policétidos, y la desestabilización de spnA, spnD o spnE eliminaba toda la producción de espinosina. La síntesis de espinosina A83543 implica también la formación de puente del núcleo de lactona, una actividad que es rara en productores de macrólido; se creía que los genes spnF, spnJ, spnL y spnM estaban implicados en esta etapa biosintética. Se ha notificado que los genes spnG, spnH, spnI y spnK están implicados en la adición y modificación de ramnosa y se ha notificado que los genes spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y spnS están implicados en la biosíntesis y adición del azúcar forosamina. Los genes requeridos para la biosíntesis de ramnosa no estaban localizados de forma contigua al resto de los genes biosintéticos de espinosina A83543. Se clonaron S. spinosa gtt y S. spinosa kre en un fragmento distinto, y se clonaron S. spinosa gdh y S. spinosa epi en otros fragmentos distintos.

Se ha dado a conocer recientemente una segunda clase de espinosinas, las butenilespinosinas, producidas por un organismo novedoso, Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) o derivados del mismo, en los documentos WO 01/19840 y US 5.817.820. Se han definido más de 40 miembros de esta familia química. Los compuestos de butenilespinosina producidos por Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) son diferentes de los compuestos de la serie de espinosina A83543. La diferencia principal entre las dos clases de espinosinas es la sustitución de la cola de carbono unida al anillo macrocíclico en C-21. Las butenilespinosinas naturales están sustituidas con una cadena de 3-4 carbonos en C-21, preferiblemente butenilo, mientras que las espinosinas A83543 naturales están sustituidas con una cadena de 1-2 carbonos en C-21, preferiblemente etilo.

Los compuestos de butenilespinosina son útiles como reactivos en la producción de compuestos espinosoides modificados sintéticamente como se dan a conocer en el documento US 6.919.464. Más preferiblemente, los compuestos de butenilespinosina y sus derivados sintéticos son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular especies de Lepidoptera y Diptera.

Además del grupo butenilo en C-21, las butenilespinosinas exhiben una serie de diferencias con la serie de espinosina A83543. Se resume en la Tabla 1 un subconjunto de compuestos de butenilespinosina y factores que demuestran diversidad respecto a espinosinas A83543. Las butenilespinosinas se nombran en la Tabla 1 y se designan de aquí en adelante por los acrónimos estructurales "for-ram-I", "for-ram-II", "for-ram-III" y derivados de los mismos. En estos casos, I, II y III designan la estructura macrólida apropiadamente sustituida (I: R⁴=R⁵=H; II: R⁵ = CH₃, R⁴ = H o OH; III: R⁵ = H, R⁴ = OH), "for" representa el azúcar en C-17 (for = forosamina), y "ram" representa el azúcar en C-9 (ram = tri-O-metilramnosa). Se designa de aquí en adelante un segundo tipo de estructura macrólida que se produce por la estirpe NRRL 30141, de fórmula general (2) que tiene un anillo macrólido de 14 miembros, como IV y el compuesto totalmente glucosilado como "for-ram-IV". Los compuestos de butenilespinosina de fórmulas (1) y (2) son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular especies de Lepidoptera y Diptera, y son bastante respetuosos con el medio ambiente y tienen un perfil toxicológico atrayente.

Estas diferencias incluyen modificaciones extensas en la posición C-21, hidroxilación en la posición C-8 y sustitución por azúcares alternativos, incluyendo azúcares neutros, de la forosamina en C-17. Además, se ha dado a conocer anteriormente en la solicitud anteriormente mencionada un compuesto que posee un sistema de anillo tricíclico 5,6,6 condensado con un anillo macrocíclico de 14 miembros con forosamina y ramnosa unidas C-17 y C-9, respectivamente.

text{*}R³ es un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas (3a) a (3c)

text{**}R9 es un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas (9a) a (9i)

Los compuestos 1-21 en la Tabla I se producen por Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) y se dan a conocer en el documento WO 01/19840. Los compuestos 32823 se dan a conocer en el documento US 5.817.820.

A pesar de las diferencias entre las estructuras de las butenilespinosinas y las espinosinas A83543, puede deducirse que algunos de los genes biosintéticos serían similares. Sin embargo, como se detalla anteriormente, la Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) produce un amplio intervalo de factores y compuestos de butenilespinosina únicos que no se han observado en espinosinas A83543. Por lo tanto, este organismo debe poseer también enzimas biosintéticas novedosas que sean distintas de las enzimas biosintéticas de espinosina A83543 de S. spinosa. Específicamente,...

1. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSb, ATb, KRb, DHb y ACPb, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518 y 2621-2710 de la SEC ID Nº 3.

2. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 2992-4239, 4483-5508, 5538-6084, 6916-7554 y/o 7861-8130 de la SEC ID Nº 1.

3. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1 ó 2, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios PKS de butenilespinosina seleccionados de KSi, ATi, ACPi, KS1, AT1, KR1 y ACP1, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 7-423, 528-853, 895-977, 2735-3160, 3241-3604, 3907-4086 y 4181-4262 de la SEC ID Nº 3.

4. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 3, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 16-1269, 1582-2559, 2683-2931, 8203-9480, 9721-10812, 11719-12258 y/o 12541-12786 de la SEC ID Nº 1.

5. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 y ACP2,estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 534-964, 990-1075, 1336-1681, 1685-1864 y 1953-2031 de la SEC ID Nº 4.

6. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 5, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 13059-14321, 14658-15900, 16026-16283, 17064-18100 y/o 18111-18650 de la SEC ID Nº 1.

7. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4 y ACP4, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 528-814, 1157-1335, 1422-1503, 1526-1949, 2063-2393, 2697-2875 y 2969-3049 de la SEC ID Nº 5.

8. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 7, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 19553-20815, 21143-22000, 23021-23557, 23816-24061, 24128-25399, 25739-26731, 27641-28183 y/o 28457-28699 de la SEC ID Nº 1.

9. La molécula de ADN aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 y ACP7, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-422, 537-864, 891-1076, 1382-1563, 1643-1724, 1746-2170, 2281-2611, 2914-3093, 3186-3267, 3289-3711, 3823-4151, 4342-4636 y 4723-4804 de la SEC ID Nº 6.

10. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 9, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 29092-30357, 30700-31683, 31762-32319, 33235-33780, 34018-34263, 34327-35601, 35932-36924, 37831-38370, 38647-38892, 38956-40224, 40560-41544, 42115-42999 y/o 43258-43503 de la SEC ID Nº 1.

11. La molécula de ADN aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 y TE10, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-424, 530-848, 885-1072, 1371-1554, 1650-1728, 1751-2175, 2289-2616, 2642-2775, 3131-3315, 3396-3474, 3508-3921, 4036-4366, 4389-4569, 4876-5054, 5148-5229 y 5278-5531 de la SEC ID Nº 7.

12. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 11, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 43945-45216, 45532-46488, 46597-47160, 48055-48606, 48892-49083, 49195-50469, 50809-51792, 51868-52269, 53335-53889, 54130-54366, 54466-55707, 56050-57042, 57109-57651, 58570-59106, 59386-59631 y/o 59776-60537 de la SEC ID Nº 1.

13. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN codifica un módulo PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 6-977 de la SEC ID Nº 3 y/o un módulo PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 998-2710 de la SEC ID Nº 3

14. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 13, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 16-2931 y/o 2992-8130 de la SEC ID Nº 1.

15. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 13 ó 14, en la que la secuencia de ADN codifica uno o más módulos PKS de espinosina adicionales seleccionados del grupo consistente en los aminoácidos 2735-4262 de la SEC ID Nº 3, 1-2031 de la SEC ID Nº 4, 1-1503 de la SEC ID Nº 5, 1526-3049 de la SEC ID Nº 5, 1-1724 de la SEC ID Nº 6, 1746-3267 de la SEC ID Nº 6, 3289-4804 de la SEC ID Nº 6, 1-1728 de la SEC ID Nº 7, 1751-3474 de la SEC ID Nº 7 y 3508-5531 de la SEC ID Nº 7.

16. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 15, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 8203-12786, 13059-19151, 19553-24061, 24128-28699, 29092-34263, 34327-38892, 38956-43503, 43945-49083, 49195-54366 y/o 54466-60537 de la SEC ID Nº 1.

17. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN codifica una enzima biosintética de butenilespinosina que comprende una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la SEC ID Nº 3, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada.

18. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 17, en la que la secuencia de ADN comprende el gen busA descrito por las bases 1-13032 de la SEC ID Nº 1.

19. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 17 ó 18, en la que la secuencia de ADN codifica una o más enzimas biosintéticas de butenilespinosinas adicionales que comprenden, respectivamente, una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la seleccionada de las SEC ID Nº 4-7 y 8-29, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada.

20. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 19, en la que la secuencia de ADN comprende los genes busB, busC, busD, busE, ORF RI, ORFRII, ORF RIII, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII y/o ORF LIX, estando descritos dichos genes, respectivamente, por las bases 13059-19505, 19553-29053, 29092-43890, 43945-60636, 62090-63937, 65229-66602 y 68762-69676 de la SEC ID Nº 1 y 114-938, 1389-2558, 2601-3350, 3362-4546, 4684-6300, 6317-7507, 7555-8403, 8640-9569, 9671-10666, 10678-12135, 12867-14177, 14627-15967, 16008-17141, 17168-17914, 18523-19932, 19982-20488, 20539-21033, 21179-21922, 22674-23453, 23690-24886, 26180-26923 y 27646-28473 de la SEC ID Nº 2.

21. Un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. Una célula hospedadora transformada con un vector recombinante de la reivindicación 21.

23. Un proceso para preparar una butenilespinosina que comprende:

cultivar un microorganismo que tiene genes biosintéticos de butenilespinosina operativos en su genoma, a condición de que el genoma del organismo se haya modificado de modo que estén presentes copias por duplicado de al menos una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20; o

cultivar un microorganismo heterólogo que se haya transformado de modo que su genoma contenga un gen biosintético de butenilespinosina operativo que comprenda una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.