Fragmentación enzimática diferencial.

Un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos,

comprendiendo el procedimiento:

(a) dividir la población de ácidos nucleicos en al menos cuatro porciones;

(b) poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus:

(c) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción;

(d) poner en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus;

(e) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción;

(f) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción;

(g) amplificar cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y

(k) comparar el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción;

(i) poner en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación;

(j) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y

(k) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/035012.

Solicitante: ORION GENOMICS, LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 4041 FOREST PARK AVENUE ST. LOUIS, MO 63108 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: JEDDELOH,Jeffrey A, LAKEY,Nathan D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12P19/34 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/48 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G06F19/00

PDF original: ES-2383970_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Fragmentación enzimática diferencial

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica beneficio de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 60/513.426, presentada el 21 de octubre de 2003, 60/561, 721, presentada el 12 de abril de 2004 y 60/561.563 presentada el 12 de abril de 2004.

Antecedentes de la invención

El ADN normalmente comprende bases metiladas y no metiladas. El ADN procariótica está metilado en los residuos de citosina y adenosina (véase, por ejemplo, McClelland y coI., Nuc. Acids. Res. 22:3640-3659 (1994) . La mutilación del ADN procariótico protege el ADN de la digestión por enzimas de restricción afines, es decir ADN extraños (que no están metilados de este modo) que se introducen en la célula son degradados por las enzimas de restricción que no pueden degradar el ADN procariótico metilado. Los patrones de mutilación del ADN se pueden usar para identificar tipos de bacterias específicos (p. ej., género, especie, cepas y aislamientos) .

El ADN de mamífero solo puede mutilarse en los residuos de citosina, normalmente estas citosinas son vecinas en 5' de guanina (CpG) . Varias líneas de evidencia han demostrado que esta metilación desempeña un papel en la actividad génica, la diferenciación celular, la tumorigénesis, la inactivación del cromosoma X, la impresión genómica y otros procesos biológicos principales (Razin y Riggs eds. en DNA Methylation Biochemistr y and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984)

En las células eucarióticos, la metilación de los residuos de citosina inmediatamente en 5' de una guanosina se produce principalmente en los loci con pocas GC (Bird, Nature 321 :209 (1986) ) . En contraste con ello, regiones pequeñas de dinucleótidos GC denominadas islas de CpG permanecen sin mutilar en las células normales, excepto durante la inactivación del cromosoma X y la impresión específica parental (Li, y col., Nature 366:362 (1993) ) en la que la metilación de las regiones reguladoras en 5' puede conducir a represión de la transcripción.

La metilación aberrante, incluida la metilación aberrante en loci específicos, a menudo se asocia con un estado patológico. Por ejemplo, la metilación de novo del gen Rb se ha demostrado en una fracción pequeña de retinoblastomas (Sakai, y col., Am. J. Hum. Genet., 48:880 (1991 ) ) y un análisis más detallado del gen VHL mostró metilación aberrante en una subpoblación de carcinomas esporádicos de células renales (Herman, y coI., PNAS USA, 91 :9700 (1994) ) . La expresión de un gen supresor tumoral también se puede anular mediante la metilación del ADN de novo de una isla de 5' CpG no metilada. Véase, por ejemplo, Issa, y col., Nature Genet. 7:536 (1994) ; Merlo, y coI., Nature Med. 1:686 (1995) ; Herman, y coI., Cancer Res. 56: 722 (1996) ; Graff, y coI., Cancer Res., 55:5195 (1995) ; Herman, y coI., Cancer Res. 55:4525 (1995) . La metilación del locus p16 se asocia con el cáncer pancreático. Véase, por ejemplo, Schutte y coI., Cancer Res. 57:3126-3131 (1997) . Los cambios de metilación en el locus II/H 19 del factor de crecimiento similar a la insulina en riñón se asocian con la tumorigénesis de Wilms. Véase , por ejemplo, Okamoto y coI., PNAS USA 94:5367-5371 (1997) .. La asociación de la alteración de la metilación en los loci p15, de E-caderina y de von Hippel-Lindau también se asocian con cáncer, Véase , por ejemplo, Herman y coI., PNAS USA 93:9821-9826 (1997) . El estado de metilación de GSTP1 se asocia con el cáncer de próstata. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5, 552, 277. Por tanto, la detección de perfiles de metilación alterados en loci en los que dichas alteraciones se asocian con enfermedad se puede usar para proporcionar diagnósticos o pronósticos de enfermedad.

Los procedimientos actuales para determinar si el ADN está metilado o sin mutilar usaron normalmente enzimas de restricción sensibles a metilación o una combinación de enzimas de restricción sensibles a metilación e insensibles a metilación (véase, por ejemplo, Burman y coI., Am. J. Hum. Genet. 65:1375-1386 (1999) ; Toyota y coI., Cancer Res. 59:2307-2312 (1999) ; Frigola y coI., Nucleic Acids Res. 30 (7) :e28 (2002) ; Steigerwald y coI., Nucleic Acid Res. 18 (6) :1435-1439 (1990) ; documento WO 03/038120; y publicación de patente de EE.UU. Nº 2003/0129602 AI. En estos procedimientos, las secuencias de ADN metiladas permanecen intactas para el análisis. Chotai y col. (1998) J. Med. Genet., 35:472-475 hace referencia a un ensayo rápido basado en PCR para diagnóstico molecular diferencial de los síndromes de Prader-Willi y Angelman. El documento US 5.912.147 se refiere a medios para cuantificar la inestabilidad genómica. Dahl et al (2003) Biogerontology, 4:233-250 se refiere a técnicas de análisis de la metilación del ADN. Chu y col. (2002) Journal of Urology, 167: 1854-1858 se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real para detectar la hipermetilación de las islas de CpG en la región promotora que flanquea al gen GSTP1 para diagnosticar el carcinoma de próstata.

Por tanto, existe la necesidad en la técnica de procedimientos más eficientes de detectar metilación de ADN, en particular ADN en loci específicos. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos de detectar metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos que usan una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación y, opcionalmente, una enzima de restricción insensible a la metilación, como se especifica en las reivindicaciones.

Una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos mediante (a) dividiendo la población de ácido nucleico en al menos cuatro porciones, (b) poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus: (c) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción;

(d) poniendo en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus; (e) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción; (f) determinando la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción; (g) amplificando cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y (h) comparando el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción; (i) poniendo en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación; (j) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y (k) determinando la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción. El procedimiento puede además comprender la identificación de mutaciones dentro del locus. En una realización, el procedimiento comprende además poner en contacto una primera porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a la metilación; amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la quinta porción para obtener una población de ácidos nucleicos que comprenden una mutación en el locus; y determinar la presencia de una mutación en el locus comparando el número de las copias intactas del locus en la quinta porción con el número de copias intactas del locus en la cuarta porción y/o las copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o las copias intactas del locus en la primera porción y/o las copias intactas del locus en la segunda porción.

El número de copias no metiladas del locus se puede determinar restando el número de copias intactas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento:

(a) dividir la población de ácidos nucleicos en al menos cuatro porciones;

(b) poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus:

(c) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción;

(d) poner en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus;

(e) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción;

(f) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción;

(g) amplificar cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y

(k) comparar el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción;

(i) poner en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación;

(j) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y

(k) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:

poner en contacto una quinta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a la metilación; amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la quinta porción para obtener una población de ácidos nucleicos que comprende una mutación en el locus; y determinar la presencia de una mutación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la quinta porción con el número de copias intactas totales del locus en la cuarta porción y/o las copias intactas del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o las copias intactas del locus en la segunda porción.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha amplificación cuantitativa es PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha amplificación cuantitativa comprende monitorizar el número de copias del locus durante la amplificación.

5. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que el número de copias se monitoriza en tiempo real.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que

los ácidos nucleico se ponen en contacto con un agente que modifica las citosinas no metiladas antes de la etapa de amplificación; y Las copias intactas del locus se amplifican con un par de cebadores oligonucleotídicos que comprenden al menos un dejador que distingue entre ADN metilado modificado y no metilado.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente es bisulfito sódico.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la metilación está en la posición N4 de una citosina dentro del locus.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima de restricción sensible a metilación no corta cuando una citosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición C5.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima de restricción dependiente de metilación es McrBC.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la presencia de metilación en el locus se compara entre al menos dos muestras de ácido nucleico.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la presencia de metilación en dos o más loci se determina

mediante amplificación cuantitativa de las copias de ADN intacto en los dos loci diferentes de una primera porción en contacto con una enzima de restricción dependiente de metilación; mediante amplificación cuantitativa del ADN intacto como los dos loci de una segunda porción en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación; y mediante comparación de las cantidades de los productos amplificados para los dos loci.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende añadir marcadores de secuencia a los extremos de una población de ácidos nucleicos antes de dividir la población de ácidos nucleicos en porciones iguales, en el que:

la etapa (c) comprende amplificar cuantitativamente las copias metiladas intactas restantes del locus en la primera porción con cebadores que inician amplificación a partir de los marcadores de secuencia; y la etapa (e) comprende cuantificar las copias no metiladas intactas restantes del locus en la segunda porción con cebadores que inician la amplificación a partir de los marcadores de secuencia.


 

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