Fracción semipurificada de Ganoderma lucidum con actividad antitumoral.

Se ha desarrollado un procedimiento de obtención de una fracción semipurificada de Ganoderma lucidum. Esta fracción se extrae por disgregación de cuerpos fructíferos, resuspensión en metanol 10%, evaporación del extracto soluble y disolución en methanol absoluto. La muestra se adsorbió en silicagel y se aplicó en columna (1x15,5 cm), cromatografiándose con fase móvil de fase móvil de butanol: ácido acético: agua (3:1:1). Las fracciones de interés presentando un Rf de 0,74 se mezclaron, se evaporó el solvente y la muestra final se resuspendió en DMSO (Dimetilsulfóxido) para obtener la Fracción Semipurificada Activa de Ganoderma lucidum (FSAGL). Esta fracción es potencialmente aplicable al tratamiento antitumoral de procesos cancerosos de tipo linfoma y leucemia

Fracción semipurificada de Ganoderma lucidum con actividad antitumoral.

Sector de la técnica

La invención se encuadra en el sector de la obtención de productos naturales de baja toxicidad tradicionalmente utilizados en Medicinas Orientales. Por tanto, puede considerarse que la invención puede ser de utilidad para el desarrollo de nuevas formulaciones farmacéuticas en el tratamiento de la actividad tumoral de células cancerosas. La invención muestra una preparación de compuestos de Ganoderma lucidum que pueden ser utilizados para tratamiento antitumorales, como leucemias humanas, linfomas, etc. Por tanto, la invención presenta aplicabilidad en el sector de productos farmacéuticos con actividad farmacológica antitumoral.

Estado de la técnica

Biotecnológicamente los hongos filamentosos y las levaduras son más conocidos que otros parientes microscópicos filamentosos que, además, se reproducen macroscópicamente de manera sexual mediante "setas" o cualquier otro tipo de fructificación de menor o mayor tamaño como el género Ganoderma.

Como fuentes de sustancias con actividad biológica, los hongos son de utilidad en medicina así como en bioindustria, y constituyen la base de varios procesos biotecnológicos para la producción comercial de muchos compuestos químicos: fármacos como, por ejemplo, la ergometrina, preparados vitamínicos y varios antibióticos, principalmente penicilina y griseofulvina [1]. Por otro lado, los hongos presentan aplicaciones en la industria químico-farmacéutica, medio-ambiental, en silvicultura, etc.

De las 14.000 especies de hongos conocidas, se considera que el 50% posee grados de comestibilidad variables, más de 2.000 son seguros y se conoce que alrededor de 700 especies poseen propiedades farmacológicas significativas 2-5. Los hongos poseen principios activos que permiten bajar el colesterol en sangre, reducir la hiperlipidemia, como antitrombóticos, moduladores de la presión arterial en la sangre. De ellos, se han aislado e identificado sustancias con efectos antivirales, inmunomoduladores, antioxidantes, cardiovasculares, antihiper-colesterolémicos, antibacteriales, antiparasitarios, hepato-protectores y antidiabéticos.

Ganoderma lucidum, "Lingzhi" en la terminología china y "Reishi" en la japonesa, se ha usado durante mucho tiempo en China para prevenir y tratar varias enfermedades humanas. Los efectos de immuno-modulación de los polisacáridos G. lucidum son extensos. Los efectos antitumorales de G. lucidum están siendo activamente investigados. Diferentes compuestos químicos [6] como triterpenos, polisacáridos, proteínas, aminoácidos, nucleósidos, esteroides, alcaloides, ácidos grasos y enzimas, se han aislado del micelio y cuerpo fructífero de diferentes especies de Ganoderma [7-10] Los constituyentes más importantes desde el punto de vista farmacológico son triterpenos y polisacáridos. Se han encontrado cerca de 150 triterpenos en especies de Ganoderma (entre ellos el ácido ganodérico C1 y el ganodermatriol). Los polisacáridos de G. lucidum se obtienen a partir de extractos acuosos como el Ganopoly®, extracto acuoso patentado (fracción polisacárida) que se encuentra en fase clínica y eficaz contra la diabetes mellitus tipo II [11]. Recientemente, se han encontrado compuestos activos en Ganoderma con numerosos efectos farmacológicos tales como antialergénico, antiviral, antihepatotóxico, cardiovascular, anti-VIH, inmunomodulador, antitumoral, entre otros.

Efectos cardiovasculares e anti-hipercolesterolémicos

Así, se evaluó la actividad cardiovascular de un extracto acuoso del micelio de G. lucidum en conejos y ratas observándose que el extracto disminuyó la tensión arterial sistólica y diastólica [12].

Efectos antibacterianos y antimicóticos

Varias especies de Ganoderma (G. lucidum, G. applanatum y G. oregonense) poseen un alto grado de actividad anti-estafilococos, estreptococos y con Bacillus pneumoniae, aumentando la actividad del sistema inmune y su efecto antiviral [13]. También se ha estudiado el efecto de extractos de G. lucidum con cuatro clases de antibióticos (ampicilina, cefazolina, oxytetraciclina y cloranfenicol) y se observándose un efecto sinérgico al combinarlo con cefazolin contra el Bacillus subtilis y Klebsiella oxytoca [14].

Efectos Antivirales

Ganoderiol F y ganodermanontriol, triterpenos aislados de extractos metanólicos de cuerpos fructíferos de G. lucidum, poseen actividad anti-VIH-1 [15].

Efectos Antitumorales

Muchos trabajos revelan que extractos de G. lucidum poseen efectos anti-proliferativos en células tumorales de leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colonrectal, cáncer de vejiga y el cáncer de próstata. Resultados obtenidos con un extracto acuoso del medio de cultivo de G. lucidum indican que la suplementación dietética con el mismo inhibe el desarrollo de tumores pulmonares, [16].

También se ha señalado que extractos acuosos de cuerpos fructíferos de G. lucidum, G. sinense, y G. tsugae tienen actividad antitumoral en células de cáncer de mama humanas y actividad immuno-moduladora en linfocitos murinos [17].

Investigando los efectos de un extracto G. lucidum en una línea celular humana de cáncer colonrectal se ha encontrado que dicho extracto inhibía la proliferación de células de cáncer humanas colonrectales y posee propiedades antioxidantes [18]. G. lucidum inhibe la proliferación celular de manera dosis y tiempo dependientes, además, induce apoptosis con una disminución en los niveles de expresión de NF-κB, Bcl-2 y Bcl-xl, aumento en la expresión de Bax causando el aumento de la proporción de Bax/Bcl-2 y Bax/Bcl-xl [19]. Estudiando el efecto de G. lucidum sobre angiogénesis relacionada con el cáncer de próstata se ha encontrado que G. lucidum inhibe eventos tempranos de la angiogénesis, en concreto la morfogénesis capilar de las células endoteliales aórticas humanas [20].

Las esporas y los cuerpos fructíferos de G. lucidum inhiben la invasión de células de cáncer de mama y próstata por un mecanismo común y pueden tener potencial terapéutico para el tratamiento de cáncer [21-23].

Apoptosis

La muerte apoptótica da lugar a una serie de cambios morfológicos muy bien definidos [24]. Tanto el núcleo como el citoplasma se condensan, el ADN se rompe, la membrana nuclear se degrada, y la célula se deforma. Por último, se forman cuerpos apoptóticos que serán fagocitados por macrófagos y células adyacentes sin que se produzca una respuesta inflamatoria.

La apoptosis se da a través de una secuencia muy bien determinada de cascadas de señalización. Se han descrito dos vías principales de señalización intracelular que dan lugar a la muerte apoptótica: la vía intrínseca y la vía extrínseca.

La vía intrínseca está regulada por los miembros de la familia de la Bcl-2 [25]. El primer miembro que se descubrió fue el protooncogen Bcl-2, observándose que su expresión no promovía la proliferación celular como otros oncogenes, sino que bloqueaba la muerte celular ante múltiples estímulos fisiológicos y patológicos [26-27].

Dentro de la familia de la Bcl-2, existen miembros anti-apoptóticos que promueven la supervivencia, y miembros pro-apoptóticos con función opuesta. El primer homólogo pro-apoptótico de la Bcl-2 descubierto fue la proteína Bax, identificada por su interacción con la Bcl-2 [28]. Todas estas proteínas presentan, como mínimo, una de las cuatro regiones o dominios homólogos a Bcl-2 (BH1-BH4, del inglés Bcl-2 homology), lo cual les permite interaccionar entre ellos formando homodímeros o heterodímeros, regulando así su función [29].

Las proteínas de la familia de la Bcl-2 se pueden regular a nivel transcripcional y post-traduccional (mediante cambios conformacionales o por fosforilación). En condiciones normales, las proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 o Bcl-xL están ancladas en determinadas membranas intracelulares como la mitocondria, el retículo endoplásmico o la membrana nuclear [30]. Ambas proteínas actúan inhibiendo a los miembros pro-apoptóticos a través de la heterodimerización con éstos [31].

En cambio, Bax se localiza en el citosol y después de un estímulo apoptótico es translocada a la membrana mitocondrial externa...

1. Procedimiento de obtención de una Fracción Semipurificada Activa de Ganoderma lucidum (FSAGL) que se compone de dos etapas de extracción y aislamiento partiendo de un extracto de cuerpos fructíferos cultivados de G. lucidum:

- Una primera etapa de extracción con metanol de cultivos de G. lucidum que consiste en disgregación del cuerpo fructífero, resuspensión del material disgregado a una concentración 50 mg/ml en metanol 10%, extracción durante 24 horas, evaporación del solvente, resuspensión del extracto metanólico en 9 ml de metanol absoluto.

- Una segunda etapa de aislamiento de la FSAGL metanol de cultivos de G. lucidum que consiste en evaporación del extracto metanólico en silicagel, aplicación en columna, elución con 3:1:1 butanol: ácido acético: agua, selección de fracciones con Rf correspondiendo a 0,74, evaporación del solvente, resuspensión de la muestra de cada fracción en 0,01 ml de DMSO, mezcla de las muestras de fracciones de Rf 0,74 para obtener la FSAGL.

2. La FSAGL obtenida según la reivindicación 1 caracterizada por presentar una composición elemental con un contenido en Carbono, Oxígeno, Hidrógeno y Nitrógeno de 49,6%, 32,3%, 7,1% y 2,9% no conteniendo Azufre y por un Rf de 0.74 en cromatografía en columna de silicagel eluyendo con 3:1:1 butanol: ácido acético: agua.

3. Uso de la FSAGL obtenida según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

4. Uso de la FSAGL obtenida según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de linfomas.

5. Uso de la FSAGL obtenida según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de leucemias.