Fosfatasa alcalina dirigida al hueso, kits y métodos de uso de la misma.

Una fosfatasa alcalina dirigida al hueso, que comprende un polipéptido que tiene la estructura:

Z-sALP-Y-espaciador-X-Wn-V,

en la que sALP es el dominio extracelular de la fasfatasa alcalina;

en la que V está ausente, o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

X está ausente, o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

Y está ausente, o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

Z está ausente, o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

Wn es un poliaspartato o un poliglutamato, en el que n ≥ 10 a 16; y el espaciador comprende una región de fragmento cristalizable (Fc),

en la que la sALP es fisiológicamente activa frente a fosfoetanolamina (PEA), pirofosfato inorgánico (PPi) y 5'-fosfato de piridoxal (PLP).

Fosfatasa alcalina dirigida al hueso, kits y mïtodos de uso de la misma CAMPO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn se refiere a fosfatasa alcalina dirigida al hueso, a kits y mïtodos de uso de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

La hipofosfatasia (HPP) es una forma rara heredable de raquitismo u osteomalacia (Whyte 2001) , con una incidencia tan grande como 1 por 2.500 nacimientos en menores canadienses (Greenberg, 1993) , y de 1 por 100.000 nacimientos en la poblaciïn general para la forma mïs grave de la enfermedad. Son mïs prevalentes las formas mïs leves. Este “error congïnito del metabolismo” estï provocado por una mutaciïn o mutaciones de pïrdida de funciïn en el gen (ALPL) que codifica la isozima no especïfica de tejidos de fosfatasa alcalina (TNALP; tambiïn conocida como ALP de tipo hepïtico/ïseo/renal) (Weiss et al. 1988; Henthorn et al. 1992a; Henthorn et al. 1992b; Zurutuza et al. 1999; Millïn 1995) . La caracterïstica bioquïmica distintiva es actividad subnormal de ALP en suero (hipofosfatasemia) , que conduce a niveles sanguïneos y/o de orina elevados de tres sustratos de fosfocompuestos: pirofosfato inorgïnico (PPi) , fosfoetanolamina (PEA) , y 5’-fosfato de piridoxal (PLP) (Whyte 1994) .

La HPP presenta un intervalo notable de gravedad, que oscila desde (en orden desde la mïs grave hasta la mïs leve) formas perinatales, infantil, de la niïez, del adulto, y odontohipofosfatasia, clasificada histïricamente segïn la edad en el momento del diagnïstico (Whyte 2001) . Puede haber una ausencia casi completa de mineralizaciïn ïsea in ïtero con alumbramiento de un mortinato, o fracturas espontïneas y enfermedad dental que aparece por primera vez en la vida adulta. La hipofosfatasia perinatal (letal) es expresada in ïtero, y puede ser la causa de alumbramiento de un mortinato. Algunos neonatos pueden sobrevivir varios dïas, pero sufren insuficiencia respiratoria aumentada, debido a la enfermedad hipoplïsica y raquïtica del pecho. En HPP infantil, diagnosticada antes de los 6 meses de edad, el desarrollo postnatal parece normal hasta el comienzo de una mala alimentaciïn, una ganancia de peso inadecuada, y la apariciïn de raquitismo. Los rasgos radiolïgicos son caracterïsticos, y muestran mineralizaciïn esquelïtica alterada, algunas veces con desmineralizaciïn esquelïtica progresiva, conduciendo a fracturas de las costillas y deformidad del pecho. La hipofosfatasia de la niïez tambiïn tiene una expresiïn clïnica muy variable. La pïrdida prematura de dientes de leche resulta de aplasia, hipoplasia o displasia de cemento dental que conecta la raïz del diente con el ligamiento periodontal. El raquitismo provoca estatura corta, y las deformidades esquelïticas pueden incluir piernas arqueadas, alargamiento de las muïecas, rodillas y tobillos como resultado de metïfisis acampanada. La HPP del adulto se presenta habitualmente durante la edad intermedia, aunque frecuentemente hay una historia de raquitismo y/o pïrdida prematura de dientes, seguido de una buena salud durante la adolescencia y la vida del adulto joven. Las fracturas recurrentes por estrïs de metatarsianos son habituales, y la deposiciïn de pirofosfato de calcio dihidratado provoca ataque de artritis y artropatïa por pirofosfato. La odontohipofosfatasia se diagnostica cuando la ïnica anormalidad clïnica es enfermedad dental, y los estudios radiolïgicos incluso biopsias ïseas no revelan signos de raquitismo u osteomalacia.

Las formas clïnicas mïs graves de hipofosfatasia se heredan habitualmente como rasgos recesivos autosïmicos, mostrando los padres de tales pacientes niveles subnormales de actividad de AP sïrica (Whyte 2001) . Para las formas mïs leves de hipofosfatasia, es decir, de adulto y odontohipofosfatasia, tambiïn se ha documentado un patrïn de herencia dominante autosïmico (Whyte 2001) .

En el esqueleto sano, TNALP es una ectoenzima presentada sobre la superficie de la membrana plasmïtica de osteoblastos y condrocitos, incluyendo en las membranas de sus vesïculas de la matriz (MVs) desprendidas (Ali et al. 1970; Bernard 1978) , en las que la enzima estï particularmente enriquecida (Morris et al. 1992) . La deposiciïn de hidroxiapatita durante la mineralizaciïn ïsea se inicia normalmente dentro de la luz de estas MVs (Anderson et al. 2005a) . La microscopïa electrïnica ha demostrado que las MVs deficientes en TNALP de pacientes con HPP afectados gravemente y ratones Akp2-/- (un modelo de ratïn carente de TNALP; vïase mïs abajo) contienen cristales de hidroxiapatita, pero que la propagaciïn de cristales extravesiculares parece retardada (Anderson 1997; Anderson 2004) . Este defecto se atribuye a la acumulaciïn extracelular de PPi, un potente inhibidor de la calcificaciïn (Meyer 1984) debido a deficiencia de la actividad de TNALP (Hessle et al. 2002; Harmey et al. 2004; Harmey et al. 2006) .

Cuando PPi estï presente a concentraciones casi fisiolïgicas, en el intervalo de 0, 01-0, 1 mM, PPi tiene la capacidad para estimular la mineralizaciïn en fïmures de polluelos cultivados en ïrganos (Anderson y Reynolds 1973) y tambiïn mediante MVs de rata aisladas (Anderson et al. 2005b) , mientras que, a concentraciïn por encima de 1 mM, PPi inhibe la formaciïn de fosfato cïlcico mineral revistiendo los cristales de hidroxiapatita, evitando asï el crecimiento de cristales minerales y la autonucleaciïn proliferativa. De este modo, PPi tiene un doble papel fisiolïgico; puede funcionar como un promotor de la mineralizaciïn a concentraciones bajas, pero como un inhibidor de la mineralizaciïn a concentraciones mïs altas. Se ha demostrado que TNALP hidroliza el inhibidor de la mineralizaciïn PPi para facilitar la precipitaciïn y crecimiento de mineral (Rezende et al. 1998) . Estudios recientes usando los ratones Akp2-/- han indicado que el papel principal de TNALP in vivo es restringir el tamaïo del conjunto de PPi extracelular para permitir la mineralizaciïn esquelïtica apropiada (Hessle et al. 2002; Harmey et al. 2004) .

La gravedad de la hipofosfatasia es variable, y estï modulada por la naturaleza de la mutaciïn de TNALP. Se ha encontrado que las mutaciones sustitutivas en la vecindad de sitios activos de enzimas, la interfaz del homodïmero, el dominio corona, el brazo aminoterminal y el sitio de uniïn de calcio afectan todos ellos a la actividad catalïtica de TNALP (Zurutuza et al. 1999) . Adicionalmente, se ha demostrado que otras mutaciones sustitutivas, sin sentido, de desplazamiento del marco y del sitio de empalme conducen a proteïnas mutantes aberrantes o defectos de trïfico intracelulares que conducen a actividad subnormal en la superficie celular. La multitud de mutaciones y el hecho de que la heterocigosidad del compuesto sea un suceso habitual en hipofosfatasia tambiïn explican la variable expresividad e incompleta penetrancia observadas a menudo en esta enfermedad (Whyte 2001) .

El progreso en la forma humana de la enfermedad se beneficia enormemente de la existencia de los ratones carentes de TNALP (Akp2-/-) como modelo de animal. Estos ratones Akp2-/- fenocopian notablemente bien HPP infantil, puesto que nacen con un esqueleto normalmente mineralizado, pero desarrollan raquitismo radiogrïficamente visible en alrededor de 6 dïas, y mueren entre los dïas 12 y 16 sufriendo una grave hipomineralizaciïn esquelïtica y episodios de apnea y ataques epilïpticos atribuibles a alteraciones en el metabolismo de PLP (vitamina B6) (Waymire et al. 1995; Narisawa et al. 1997; Fedde et al. 1999; Narisawa et al. 2001) .

Se ha demostrado que algunas mutaciones de sitio activo de TNALP afectan a la capacidad de la enzima para metabolizar PPi o PLP de forma diferente (Di Mauro et al. 2002) . Tanto PLP como PPi son sustratos naturales confirmados de TNALP, y las anormalidades en el metabolismo de PLP explican los ataques epilïpticos observados en ratones Akp2-/- (Waymire et al. 1995; Narisawa et al. 2001) , mientras que las anormalidades en el metabolismo de PPi explican el fenotipo esquelïtico en este modelo de ratïn de hipofosfatasia (Hessle et al. 2002; Anderson et al. 2004; Harmey et al. 2004; Harmey et al. 2006; Anderson et al. 2005a) .

No hay ninguna terapia mïdica confirmada para HPP. Los informes de casos de terapia de sustituciïn enzimïtica (ERT) usando infusiones intravenosas (i.v.) de plasma rico en TNALP de pacientes con enfermedad ïsea de Paget y ALP placentaria purificada han descrito la imposibilidad de salvar lactantes afectados (Whyte et al. 1982; Whyte et al. 1984) . En otro estudio similar, Weninger et al. (Weninger et al. 1989) intentaron una ERT para un niïo prematuro gravemente afectado con hipofosfatasia mediante infusiones de TNALP hepïtica humana purificada. El tratamiento (1, 2 UI/kg/min.) comenzï a la edad... [Seguir leyendo]

1. Una fosfatasa alcalina dirigida al hueso, que comprende un polipïptido que tiene la estructura:

Z-sALP-Y-espaciador-X-Wn-V,

en la que sALP es el dominio extracelular de la fasfatasa alcalina;

en la que V estï ausente, o es una secuencia de aminoïcidos de al menos un aminoïcido;

X estï ausente, o es una secuencia de aminoïcidos de al menos un aminoïcido;

Y estï ausente, o es una secuencia de aminoïcidos de al menos un aminoïcido;

Z estï ausente, o es una secuencia de aminoïcidos de al menos un aminoïcido;

Wn es un poliaspartato o un poliglutamato, en el que n = 10 a 16; y el espaciador comprende una regiïn de fragmento cristalizable (Fc) ,

en la que la sALP es fisiolïgicamente activa frente a fosfoetanolamina (PEA) , pirofosfato inorgïnico (PPi) y 5’-fosfato de piridoxal (PLP)

2. La fosfatasa alcalina de la reivindicaciïn 1, en la que el Fc comprende un dominio CH2, un dominio CH3 y una regiïn de bisagra, o en la que el Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 e IgG-4, preferiblemente en la que el Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina IgG-1.

3. La fosfatasa alcalina de la reivindicaciïn 2, en la que el Fc es como se expone en SEC ID NO: 3.

4. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que: a) la sALP comprende los restos de aminoïcido.

2. 508 de SEC ID NO: 15, preferiblemente en la que la sALP consiste en los restos de aminoïcido.

2. 512 de SEC ID NO: 15, o b) la sALP comprende los restos de aminoïcido.

2. 508 de SEC ID NO: 18, preferiblemente en la que la sALP consiste en los restos de aminoïcido.

2. 512 de SEC ID NO: 18, o c) la sALP comprende los restos de aminoïcidos 18-498 de SEC ID NO: 16, preferiblemente en la que la sALP consiste en los restos de aminoïcidos 18-502 de SEC ID NO: 16, o d) la sALP comprende los restos de aminoïcidos 18-498 de SEC ID NO: 19, preferiblemente en la que la sALP consiste en los restos de aminoïcidos 18-502 de SEC ID NO: 19.

5. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina no especïfica de tejidos

6. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que Wn es un poliaspartato, preferiblemente en el que n = 10.

7. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que Z estï ausente, y/o en la que V estï ausente.

8. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que

a) Y es un resto de dos aminoïcidos, preferiblemente en la que Y es leucina-lisina; y/o b) X es un resto de dos aminoïcidos, preferiblemente en la que X es aspartato-isoleucina.

9. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende el polipïptido en una forma que comprende un dïmero.

10. La fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha fosfatasa alcalina consiste en dicho polipïptido, y en la que Z y V estïn ausentes.

11. Una composiciïn farmacïutica que comprende la fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehïculo farmacïuticamente aceptable, preferiblemente en la que el vehïculo farmacïuticamente aceptable es una disoluciïn salina, mïs preferiblemente en la que la fosfatasa alcalina estï en una forma liofilizada.

12. La fosfatasa alcalina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composiciïn farmacïutica de la reivindicaciïn 11, para uso como un medicamento, preferiblemente en la que la fosfatasa alcalina es en una dosificaciïn diaria de alrededor de 0, 2 a alrededor de 20 mg/kg, o una dosificaciïn semanal de alrededor de 1, 4 a alrededor de 140 mg/kg.

13. Un ïcido nucleico aislado que comprende o consiste en una secuencia que codifica el polipïptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. Un vector de expresiïn recombinante que comprende el ïcido nucleico de la reivindicaciïn 13.

15. Un vector vïrico adenoasociado recombinante que comprende el ïcido nucleico de la reivindicaciïn 13.

16. Una cïlula hospedante recombinante aislada, transformada o transfectada con el vector de la reivindicaciïn 14 ï

15.

17. Un mïtodo para producir la fosfatasa alcalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar la cïlula hospedante de la reivindicaciïn 16 en condiciones adecuadas para efectuar la expresiïn de la fosfatasa alcalina, y recuperar la fosfatasa alcalina del medio de cultivo preferiblemente en el que la cïlula hospedante es una cïlula L, cïlula C127, cïlula 3T3, cïlula BHK, cïlula COS-7 o una cïlula de ovario de hïmster chino (CHO) , mïs preferiblemente en el que la cïlula hospedante es una cïlula de ovario de hïmster chino (CHO) , mïs preferiblemente en el que la cïlula hospedante es una cïlula CHO-DG44.

18. Un kit que comprende la fosfatasa alcalina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, e instrucciones para uso en un mïtodo para corregir o evitar un fenotipo de hipofosfatasia (HPP) .

19. Una fosfatasa alcalina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en un mïtodo para corregir o evitar al menos un fenotipo de hipofosfatasia (HPP) en un sujeto que lo necesite.

20. La fosfatasa alcalina para el uso de la reivindicaciïn 19, en la que

a) el sujeto tiene al menos un fenotipo de HPP, preferiblemente en la que i) el al menos un fenotipo de HPP comprende ataque relacionado con HPP, o ii) el al menos un fenotipo de HPP comprende pïrdida prematura de dientes de leche, o iii) el al menos un fenotipo de HPP comprende mineralizaciïn ïsea incompleta, preferiblemente en el

que la mineralizaciïn ïsea incompleta es mineralizaciïn ïsea femoral incompleta o mineralizaciïn ïsea tibial incompleta, o mineralizaciïn ïsea metatarsiana incompleta, o mineralizaciïn ïsea incompleta de las costillas, o iv) el al menos un fenotipo de HPP comprende niveles elevados sanguïneos y/o de orina de pirofosfato inorgïnico (PPi) , o v) el al menos un fenotipo de HPP comprende niveles elevados sanguïneos y/o de orina de fosfoetanolamina (PEA) , o vi) el al menos un fenotipo de HPP comprende niveles elevados sanguïneos y/o de orina de 5’-fosfato de piridoxal (PLP) , o vii) el al menos un fenotipo de HPP comprende ganancia de peso inadecuada; o viii) el al menos un fenotipo de HPP comprende raquitismo, o ix) el al menos un fenotipo de HPP comprende dolor ïseo, o x) el al menos un fenotipo de HPP comprende deposiciïn de cristales de pirofosfato de calcio dihidratado; o xi) el al menos un fenotipo de HPP comprende aplasia, hipoplasia o displasia del cemento dental.

21. La fosfatasa alcalina para el uso de la reivindicaciïn 19 ï 20, en la que el sujeto que la necesita tiene a) HPP de lactante; o b) HPP de la niïez; o c) HPP perinatal; o d) HPP de adulto; o e) HPP de odontohipofosfatasia.

22. La fosfatasa alcalina para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el uso comprende transfectar una cïlula en el sujeto con un ïcido nucleico que codifica la fosfatasa alcalina, en particular en la que la transfecciïn de la cïlula se lleva a cabo in vitro de manera que la fosfatasa alcalina es expresada y segregada en

una forma activa, y es administrada al sujeto con dicha cïlula.

23. La fosfatasa alcalina para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el uso comprende la administraciïn subcutïnea o intravenosa de la fosfatasa alcalina al sujeto.