Formas variantes de urato oxidasa y uso de las mismas.

Una uricasa de mamífero truncada aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de uricasa de mamífero truncada en el extremo amino,

o el extremo carboxílico, o ambos de los extremos amino y carboxílico por 6 aminoácidos; y que comprende adicionalmente una sustitución aminoacídica con treonina en la posición 7 (D7T), una sustitución aminoacídica con treonina en la posición 46 (S46T), una sustitución aminoacídica con lisina en la posición 291 (R291K) y una sustitución aminoacídica con serina en la posición 301 (T301S), siendo dichos truncamiento y sustitución aminoacídica relativos a una uricasa de cerdo de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

Formas variantes de urato oxidasa y uso de las mismas Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad o el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. con n.° de serie: 6/67,573, presentada el 11 de abril de 25 por referencia en el presente documento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas con actividad ureolítica modificadas genéticamente. Más específicamente, la invención se refiere a proteínas que comprenden urato oxidasas truncadas y a procedimientos para su producción.

Antecedentes de la invención

Los términos urato oxidasa y uricasa se usan en el presente documento de manera intercambiable. Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son enzimas que catalizan la oxidación de ácido úrico en un producto más soluble, alantoína, un metabolito de purina que se excreta más fácilmente. Los seres humanos no producen uricasa enzimáticamente activa, como resultado de varias mutaciones en el gen para uricasa adquirido durante la evolución de los primates superiores. Wu, X, et ál., (1992) J Mol Evol 34:78-84.

Como consecuencia, en individuos propensos, las concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre (hiperuricemia) pueden conducir a artritis dolorosa (gota), depósitos de uratos desfigurantes (tofos) e insuficiencia renal. En algunos individuos afectados, los fármacos disponibles, tales como alopurinol (un inhibidor de la síntesis de ácido úrico), producen efectos adversos que limitan el tratamiento o no alivian adecuadamente estas dolencias. Hande, KR, et ál., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (199) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192.

Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia y hiperuricosuria, al menos de manera transitoria. Puesto que la uricasa es una proteína exógena en los seres humanos, incluso la primera inyección de la proteína no modificada a partir de Aspergillus flavus ha inducido reacciones anafilácticas en varios porcentajes de pacientes tratados (Pui, C-H, et ál., (1997) Leukemia 11:1813-1816, y las respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento crónico o intermitente. Donadío, D, et ál., (1981) Nouv Presse Med 1:711-712; Leaustic, M, et ál., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 5:553-554.

Se ha aceptado durante varias décadas el funcionamiento subóptimo de tratamientos disponibles para la hiperuricemia. Kissel, P, et ál., (1968) Nature 217:72-74.

De manera similar, se ha aceptado durante varios años la posibilidad de que ciertos grupos de pacientes con gota aguda se puedan beneficiar de una forma segura y eficaz de uricasa inyectable. Davis, FF, et ál., (1978) en GB Broun, et ál., (eds.) Enzyme Engineering, Vol 4 (pp. 169-173) Nueva York, Plenum Press; Nishimura, H, et ál., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et. ál., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et ál., (1981) Lancet 2(8241 ):281-283; Abuchowski, A, et ál., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, et ál., (1981) Biochim Biophys Acta 66:293-298; Chua, CC, et ál., (1988) Ann Int Med 19:114-117; Greenberg, ML, et ál., (1989) Anal Biochem 176:29-293.

Las uricasas derivadas de órganos de animales son prácticamente insolubles en disolventes que son compatibles con una administración segura por inyección. Patente de EE. UU. n.° 3,616,231.

Ciertas uricasas derivadas de plantas o de microorganismos son más solubles en disolventes médicamente aceptables. Sin embargo, la inyección de las enzimas microbianas induce rápidamente respuestas inmunitarias que pueden conducirá reacciones alérgicas que comprometen la vida o a una inactivación y/o desaparición acelerada de la uricasa de la circulación. Donadío, et ál., (1981); Leaustic, et ál., (1983). Las enzimas basadas en las secuencias de aminoácidos deducidas de uricasas a partir de mamíferos, incluyendo cerdo y babuino, o a partir de insectos, tales como, por ejemplo, Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et ál., (199) Mol Cell Biol 1:5114-5127), no han sido candidatas adecuadas para el uso clínico, debido a los problemas de inmunogenia e insolubilidad a un pH fisiológico.

Los investigadores han usado previamente uricasa inyectada para catalizar la conversión de ácido úrico en alantoína in vivo. Véase Pui, et ál., (1997). Esta es la base para el uso en Francia e Italia de uricasa a partir del hongo Aspergillus fíavus (Uricozyme®) para prevenir o corregir temporalmente la hiperuricemia asociada con el tratamiento antineoplásico para neoplasias malignas y reducir de manera transitoria la hiperuricemia aguda en pacientes con gota. Potaux, L, et ál., (1975) Nouv Presse Med 4:119-1112; Legoux, R, et ál., (1992) J Biol Chem 267:8565-857; patentes de EE. UU. 5,382,518 y 5,541,98. A causa de su corta semivida en circulación, Uricozyme® requiere inyecciones diarias. Lo que es más, a causa de su inmunogenia, no es muy adecuada para el tratamiento a largo plazo.

Ciertas uricasas son muy útiles para preparar conjugados con poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno) (ambos denominados PEG) para producir formas terapéuticamente eficaces de uricasa que tengan semivida de proteína

incrementada e inmunogenia reducida. Patentes de EE. UU. 4,179,337, 4,766,16, 4,847,325, y 6,576,235; Publicación de solicitud de patente de EE. UU. US23/82786A1. También se han descrito conjugados de uricasa con polímeros distintos a PEG. Patente de EE. UU, 4,46,683.

En prácticamente todos los intentos evidenciados para PEGilar uricasa (es decir, unir covalentemente PEG a uricasa), en primer lugar el PEG se enlaza a los grupos amino, incluyendo el residuo amino terminal y los residuos de Usina disponibles. En las uricasas utilizadas habltualmente, el número total de Usinas en cada una de las cuatro subunldades Idénticas está entre 25 (Aspergillus flavus (patente de EE. UU. 5,382,518)) y 29 (cerdo (Wu, X, et ál.,(1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:9412-9416)). Algunas de las Usinas no están disponibles para la PEGilación en la conformación natural de la enzima. El planteamiento más habitual para reducirla Inmunogenia de la uricasa ha sido unir grandes números de cadenas de PEG de bajo peso molecular. Esto ha dado como resultado grandes disminuciones en la actividad enzimática de los conjugados resultantes.

Una única inyección intravenosa de una preparación de uricasa de Candida utilis unida a PEG de 5 kDa redujo el urato sérico hasta niveles indetectables en cinco sujetos humanos, cuya concentración de urato sérico promedio previa a la inyección es de 6,2 mg/dl, que está dentro del intervalo normal. Davis, et ál., (1981). Cuatro semanas más tarde, se dio una inyección adicional a los sujetos, pero sus respuestas no se evidenciaron. No se detectaron anticuerpos frente a uricasa tras la segunda (y última) inyección, usando un ensayo de difusión en gel relativamente insensible. Esta referencia no evidenció resultados a partir de tratamientos crónicos o subcrónicos de pacientes humanos o animales de experimentación.

Se usó una preparación de uricasa a partir de Arthrobacter protoformiae unida a PEG de 5 kDa para controlar temporalmente la hiperuricemia en un único paciente con linfoma cuya concentración de urato sérico previa a la inyección es 15 mg/dl. Chua, et ál., (1988). A causa de la condición critica del paciente y la corta duración de tratamiento (cuatro inyecciones durante 14 días), no es posible evaluar la eficacia o seguridad del conjugado a largo plazo.

Se posibilita la protección mejorada a partir de reconocimiento inmunitario modificando cada subunidad de uricasa con 2-1 cadenas de PEG de alto peso molecular (>5 kD-12 kD) Saifer, et ál. (Patente de EE. UU. 6,576,235; (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387).

Esta estrategia posibilitó la retención de >75 % de la actividad enzimática de uricasa a partir de varias especies, tras la PEGilación, aumentó la vida de circulación de uricasa, y posibilitó la inyección repetida de la enzima sin provocar anticuerpos en ratones y conejos.

Hershfield y Kelly (publicación de patente internacional WO /8196; solicitud de EE. UU. n.° 6/95,489) desarrollaron medios para proporcionar proteínas uricasas recombinantes de especies de mamífero con números óptimos de sitios de PEGilación. Usaron técnicas de PCR para incrementar el número de residuos de lisina disponibles en puntos seleccionados en la enzima, lo que está diseñado para posibilitar el reconocimiento reducido por el sistema inmunitario, después de subsiguiente PEGilación, mientras se retiene sustancialmente la actividad ureolítica de la enzima. Algunas de sus proteínas uricasas están truncadas en los extremos carboxílico y/o amino. No proporcionan la dirección de otras alteraciones específicas... [Seguir leyendo]

1. Una uricasa de mamífero truncada aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de uricasa de mamífero truncada en el extremo amino, o el extremo carboxílico, o ambos de los extremos amino y carboxílico por 6 aminoácidos; y que comprende adicionalmente una sustitución aminoacídica con treonina en la posición 7 (D7T), una sustitución aminoacídica con treonina en la posición 46 (S46T), una sustitución aminoacídica con Usina en la posición 291 (R291K) y una sustitución aminoacídica con serina en la posición 31 (T31S), siendo dichos truncamiento y sustitución aminoacídica relativos a una uricasa de cerdo de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

2. La uricasa de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un aminoácido aminoterminal, en la que el aminoácido aminoterminal es alanina, glicina, prolina, serina, o treonina.

3. La uricasa de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.

4. La uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la uricasa se conjuga con un polímero.

5. Un conjugado de polietilenglicol-uricasa que comprende la uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. El conjugado de la reivindicación 5, que comprende de 2 a 12 moléculas de polietilenglicol en cada subunidad de uricasa.

7. El conjugado de la reivindicación 5, en el que cada molécula de polietilenglicol tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y 1 kD.

8. Una composición farmacéutica que comprende una uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. La proteína uricasa de mamífero truncada aislada de la reivindicación 1, en la que el aminoácido N-terminal es metionina.

1. La uricasa de la reivindicación 9, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7.

11. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la uricasa de la

reivindicación 1, reivindicación 2, reivindicación 9 o reivindicación 1.

12. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una uricasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7 o SEQ ID NO. 8.

13. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 12, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende las SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 1.

14. El ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 11 o 12, en el que la secuencia de ácidos nucleicos está ligada funclonalmente a un promotor heterólogo.

15. El ácido nucleico de la reivindicación 14, en el que el promotor es el promotor osmB.

16. Un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14.

17. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 16.

18. Un procedimiento para producir una uricasa que comprende las etapas de cultivar una célula huésped de la reivindicación 17 en condiciones tales que la secuencia de ácidos nucleicos se expresa mediante la célula huésped y aislar la uricasa expresada.

19. La uricasa de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7.

2. Un conjugado de polietilenglicol-uricasa que comprende la uricasa de la reivindicación 19.

21. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de las reivindicaciones 5 o 2.

22. La composición de las reivindicaciones 8 o 21, adecuada para administración a largo plazo.

23. Una composición de las reivindicaciones 8, 21 o 22 para su uso en la reducción de los niveles de ácido úrico

en un fluido biológico de un sujeto.

24. La composición para su uso en la reducción de los niveles de ácido úrico en un fluido biológico de un sujeto de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el fluido biológico es sangre.

25. La uricasa de la reivindicación 1, en la que la uricasa comprende una uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino, o una quimera de las mismas.

26. El conjugado de la reivindicación 7, en el que cada molécula de polletllengllcol tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y 5 kD.

27. El conjugado de la reivindicación 26, en el que cada molécula de polietllengllcol tiene un peso molecular entre

aproximadamente 5 kD y 2 kD.

28. El conjugado de la reivindicación 27, en el que cada molécula de polietllengllcol tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD.