Fitasas.

Molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre:

i) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o unasecuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número deacceso NCIMB 41248;

un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia denucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número deacceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de almenos el 80% con ésta; y

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número deacceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp.depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene unaidentidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de almenos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido enuna solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3,5 a unatemperatura de 37 °C;

ii) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia presentada en la SEQ ID n.º 2;

iii) un ácido nucleico que se hibrida con la SEQ ID n.º 2 en condiciones rigurosas a 50 °C y SSC a 0,2X

Fitasas La presente descripción se refiere a las fitasas, secuencias de nucleótidos para las mismas, métodos de producción de fitasas y su uso.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las enzimas para aditivos de productos alimenticios. Más específicamente, la presente invención se refiere a las fitasas que se pueden utilizar para mejorar la digestión del fosfato de los alimentos y de los piensos para consumo animal.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Y TÉCNICA PREVIA

El fitato es la principal forma de almacenamiento del fósforo en los cereales y en las legumbres. Sin embargo, los animales monogástricos, tales como el cerdo, las aves de corral y los peces, no son capaces de metabolizar ni de absorber el fitato (o ácido fítico) y, por consiguiente, se excreta, lo que conduce a la contaminación fosfórica en las áreas de producción intensiva de ganado. Además, el ácido fítico también actúa como un antinutriente en los animales monogástricos al quelar los metales tales como calcio, cobre y cinc.

Para proporcionar fosfatos suficientes para el crecimiento y la salud de estos animales, se les añade el fosfato inorgánico en la dieta. Tal adición puede ser costosa e incrementa adicionalmente los problemas de contaminación.

Mediante la acción de la fitasa, el fitato se hidroliza por lo general para dar fosfatos de inositol inferiores y fosfato inorgánico. Las fitasas son útiles como aditivos en los piensos para consumo animal porque mejoran la disponibilidad del fósforo orgánico para el animal y disminuyen la contaminación fosfórica del medio ambiente (Wodzinski, R. J., Ullah A. H., Adv. Appl. Microbiol. 42, 263-302 (1996) ) .

En la bibliografía se han descrito una serie de fitasas de origen fúngico (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2) , 367-373 (1999) ; Berka R. M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11) , 4423-4427 (1998) ; Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10) , 4701-4707 (2001) ) y bacteriano (Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107113 (1993) ; Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6) , 2079-2085 (1998) ; Kim H. W. et al. Biotechnol. Lett. 25,

1231-1234 (2003) ; Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2) , 201-206 (1997) ; Yoon S. J. et al., Enzyme and microbioal technol. 18, 449-454 (1996) ; Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004) ) .

Por ejemplo, las enzimas fitasa mutantes de E. coli y las variantes naturales de las mismas se conocen a partir de la patente internacional WO 2004/015084, y las fitasas producidas por Citrobacter braakii se conocen a partir de la patente internacional WO2004/085638. Se han dado a conocer otras fitasas bacterianas mediante métodos de muestreo y escrutinio (Zinn N. V. et al., Biotechnologia, Glavnoe Upravlenie Mikrobiologiceskoj Promy Lennosti Pri, 2, 3-10 (2003) ) .

No obstante, hasta la fecha, ninguna de estas fitasas presenta las propiedades necesarias para el uso eficaz como suplemento de los piensos para consumo animal. En particular, las fitasas fúngicas tienden a ser proteolíticamente inestables (Igbasan F. A. et al, Arch. Anim. Nutr. 53, 353-373 (2000) ) y, por lo tanto, son vulnerables a la 35 degradación, mientras que la mayor parte de las fitasas bacterianas tienen una estrecha especificidad de sustrato solo por el fitato y degradan mal los fosfatos de inositol de grados intermedios de fosforilación (Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107-113 (1993) ; Kerovuo J. et al., Biochem. J. 352, 623-628 (2000) ) . Se reconoce que una fitasa estable ácida y termoestable con una amplia especificidad de sustrato y actividad específica alta es muy deseable, en particular para propósitos de nutrición animal (Vats P et al., Enzyme and Microbial Technology. 35,

3-14 (2004) ) .

Por consiguiente, se necesitan fitasas mejoradas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican fitasas procedentes de una bacteria y formas modificadas de las mismas. En particular, la invención se refiere a moléculas 45 de ácido nucleico aisladas que codifican fitasas procedentes de la bacteria, Buttiauxella sp., y formas modificadas/variantes de las mismas seleccionadas y/o modificadas genéticamente para mejorar sus características en comparación con la enzima de tipo silvestre (madre) .

La presente invención es ventajosa porque da a conocer una molécula de ácido nucleico aislada que codifica nuevas fitasas que tienen propiedades que las hacen particularmente útiles y eficaces como enzimas para piensos. En 50 particular, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica nuevos polipéptidos de fitasa purificados y/o aislados como se describe en la presente memoria, o un fragmento funcional, o variantes o formas modificadas de los mismos, o forma modificada de los mismos.

Para ser eficaz como aditivo enzimático para alimentos o para pienso para consumo animal, la fitasa tiene que combinar una serie de propiedades diferentes. Para poder degradar el ácido fítico en el medio ácido del estómago de un animal, tiene que permanecer activa a pH bajo, preferentemente a lo largo de un amplio margen de valores de pH. Además, tiene que tener una elevada actividad específica y preferentemente una termoestabilidad elevada para permitir que la proteína resista las temperaturas altas utilizadas de forma habitual en la preparación de productos alimenticios para consumo animal tales como los piensos granulados.

También es importante que la enzima tenga una amplia especificidad de sustrato que le permita hidrolizar no sólo el fitato, sino también los productos intermedios de la degradación del fitato, tales como pentafosfatos, tetrafosfatos y trifosfatos de inositol. Los estudios sobre la degradación del fitato en los cerdos demuestran que estos oligofosfatos de inositol permanecen en su mayor parte insolubles en el intesto delgado y en el grueso y, por consiguiente, inaccesibles a las fosfatasas alcalinas producidas por el animal y la microflora intestinal (Schlemmer U. et al. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001) ) . Se han identificado variaciones de los perfiles de especificidad de sustrato en diferentes enzimas. Por ejemplo, los trifosfatos de inositol generados por la fitasa de B. subtilis son esencialmente resistentes a la hidrólisis posterior por esta enzima [Kerovuo J. et al., Biochem. J. 352, 623-628 (2000) ].

En otro aspecto de la invención se da a conocer un plásmido o un sistema de vector, o un transformante o un organismo transgénico que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una nueva fitasa como se describe en la presente memoria o una forma modificada de la misma.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a organismos transgénicos modificados para que expresen una nueva fitasa como la descrita en la presente memoria o una forma modificada de la misma y, por lo tanto, sean capaces de producir una fitasa. La presente invención da a conocer adicionalmente medios y métodos para producir fitasas mediante biotecnología y describe su uso como complemento para los piensos.

Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el comentario que viene a continuación.

Para facilidad de referencia, estos y otros aspectos de la presente invención se explican ahora en los encabezamientos de apartados apropiados. No obstante, las enseñanzas en cada apartado no se limitan necesariamente a cada apartado en particular.

Tal y como se utiliza con referencia a la presente invención, la terminología «producir», «que produce», «producido», «producible», «producción» es sinónima de la terminología correspondiente «preparar», «que prepara», «preparado», «preparación», «generado», «generación» y «preparable».

Tal y como se usa con referencia a la presente invención, la terminología «expresión», «expresa», «expresado» y «expresable» es sinónima de la terminología correspondiente «transcripción», «transcribe», «transcrito» y «transcribible».

Tal y como se usa con referencia a la presente invención, la terminología «transformación» y «transfección» se refieren a un método que introduce secuencias de ácido nucleico en hospedadores, células hospedadoras, tejidos u órganos.

Otros aspectos que se refieren a las secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen: una construcción que comprende las secuencias de la presente invención; un vector que comprende las secuencias para uso en la presente invención; un plásmido que comprende las secuencias para uso en la presente... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre:

i) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

! un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una 5 secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

! un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de 10 acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al

menos el 80% con ésta; y

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp.

depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5 a una temperatura de 37 °C;

ii) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia presentada en la SEQ ID n.º 2;

iii) un ácido nucleico que se hibrida con la SEQ ID n.º 2 en condiciones rigurosas a 50 °C y SSC a 0, 2X.

2. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

! un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

! un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con ésta; y

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta;

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina incubando dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5 a una temperatura de 37 °C.

3. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, que comprende una secuencia de nucleótidos que es la misma que la de la SEQ ID n.º 2, o que es complementaria a ella, o que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEQ ID n.º 2.

4. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad máxima alrededor de pH 3 a 6, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

5. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha

molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad máxima a aproximadamente pH de 4 a 5, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

6. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha

molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad máxima a aproximadamente pH 4, 5, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

7. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende mutaciones en al menos una de las posiciones siguientes, numeradas de acuerdo con la numeración en la SEQ ID n.º 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S 225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I336 o N351.

8. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una o más de las siguientes mutaciones: 15 K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o 20 H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o 25 S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o G 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, o Y; o K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o 30 D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, oY;o A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M; N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, o Y; o A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o 35 N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y.

9. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende al menos una mutación seleccionada entre el 40 grupo que consiste en: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K o F197S.

10. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una combinación de mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: D125E/H193R; o A294E/N303K; o 5 T167I/K240T; o D223E/K240E/N351D; o T167I/K240T/A294E/N303K; o T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; o A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; o 10 A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; o A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; o D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; o A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F; o N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K. 15 11. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la combinación de las mutaciones: A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K.

12. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido es una variante de la enzima fitasa que tiene mayor

termoestabilidad y/o mayor actividad específica y/o mayor estabilidad proteolítica que la enzima fitasa codificada por la SEQ ID n.º 2.

13. Sistema de plásmido o de vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Sistema de plásmido o de vector de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho sistema de plásmido o de

vector es un vector de expresión para la expresión de uno cualquiera de los polipéptidos que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y/o comprende polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un microorganismo.

15. Célula hospedadora transformada o transfectada con un sistema de plásmido o de vector como el descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

16. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 15, que expresa un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

17. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde dicha célula hospedadora procede de un microorganismo.

18. Célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde dicha célula 35 hospedadora se selecciona entre bacterias y hongos.

19. Célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde dicha célula hospedadora se selecciona entre bacterias, levadura y hongos filamentosos.

20. Célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde dicha célula

hospedadora se selecciona entre B. subtilis, E. coli, H. polymorpha, S. pombe, S. cerevisiae, Trichoderma spp y 40 Aspergillus spp.

21. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho Aspergillus spp. es A. or y zae.

22. Célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde dicha célula hospedadora es una célula bacteriana procariota, preferentemente E. coli.

23. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha célula hospedadora es E. coli.

24. Cepa de célula bacteriana Buttiauxella sp. P1-29 depositada con el número de acceso NCIMB 41248.

25. Método de producción de un polipéptido que comprende transformar una célula hospedadora con un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:

! un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

! un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5 a una temperatura de 37 °C.

26. Método de producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende transformar una célula hospedadora con un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 con un plásmido o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

27. Método de producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 25 o con la reivindicación 26, en donde dicha célula hospedadora es una célula hospedadora como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24.

28. Método de producción de un polipéptido que comprende la expresión de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:

! un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

! un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5, a una temperatura de 37 °C.

29. Método de producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende la expresión de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un plásmido o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

30. Método de producción de un polipéptido que comprende la expresión de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una célula hospedadora en un medio de cultivo y la separación de dicho polipéptido del medio de cultivo de las células hospedadoras, en donde dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:

! un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

! un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

! un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5 a una temperatura de 37 °C.

31. Método de producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende la expresión de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un plásmido o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 en una célula hospedadora.

32. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con ésta.

33. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248.

34. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con ésta.

35. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2.

36. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se hibrida a la SEQ ID n.º 2 en condiciones rigurosas a 50 °C y SSC a 0, 2X.

37. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3.

38. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con la SEQ ID n.º 3.

39. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95% con la SEQ ID n.º 3.

40. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 96% con la SEQ ID n.º 3.

41. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha

molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con la SEQ ID n.º 3.

42. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 98% con la SEQ ID n.º 3.

43. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con la SEQ ID n.º 3.

SDS-PAGE de P1-29

Distancia de migración, mm

Figura 1

Perfil de actividad de lafitasade P1-29 con elpH

0, 0 1, 0 2, 0 3, 0 4, 0 5, 0 6, 0 7, 0 8, 0

Figura 2

P1-29

Figura 3