Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilados.

Un péptido del factor estimulante de colonias de granulocitos que comprende el resto:

**Fórmula**

donde

D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-;

G es un miembro seleccionado de R1-L- y -C(O)alquilo (C1-C6);

R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de:**Fórmula**

Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilados Antecedentes de la invención EL factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una glicoproteína que estimula la supervivencia, proliferación, diferenciación y la función de células progenitoras de granulocitos neutrófilos y neutrófilos maduros. Las dos formas de G-CSF humano recombinante en uso clínico son estimulantes potentes de la granulopoyesis de neutrófilos y han demostrado eficacia en la prevención de complicaciones infecciosas de algunos estados neutropénica. Se pueden utilizar para acelerar la recuperación de neutrófilos de los tratamientos mielosupresores.

G-CSF disminuye la morbilidad de la quimioterapia del cáncer mediante la reducción de la incidencia de la neutropenia febril, la morbilidad de la quimioterapia de dosis alta con el apoyo de un trasplante de médula, y la incidencia y duración de la infección en pacientes con neutropenia crónica severa. Además, se ha demostrado recientemente que el G-CSF tiene acción terapéutica cuando se administra después del inicio del infarto de miocardio.

La forma humana de G-CSF fue clonada por grupos de Japón y Estados Unidos en 1986 (ver, por ejemplo, Nagata et al Nature 319: 415-418, 1986) . La glicoproteína humana natural existe en dos formas, una de 175 y la otra de 178 aminoácidos. La forma más abundante y más activa de 175 aminoácidos se ha utilizado en el desarrollo de productos farmacéuticos por tecnología de ADN recombinante.

El G-CSF humano recombinante sintetizado en un sistema de expresión de E. coli se llama filgrastim. La estructura de filgrastim difiere ligeramente de la glicoproteína natural. La otra forma de G-CSF humano recombinante se llama lenograstim y se sintetiza en las células de ovario de hámster chino (CHO) .

hG-CSF es una proteína monomérica que dimeriza el receptor de G-CSF por formación de un complejo 2:2 de 2 moléculas de G-CSF y 2 receptores (Horan et al Biochemistr y , 35 (15) : 4886–96 (1996) ) . Los siguientes residuos de hG-CSF se han identificado mediante estudios cristalográficos de rayos X como partes de la interfaces de unión al receptor: G4, P5, A6, S7, 58, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, Tl 15, T116, Q119, E122, E123, y L124 (ver, por ejemplo, Aritomi et al., (1999) Nature 401: 713) .

Las formas disponibles en el comercio de rhG-CSF tienen un efecto farmacológico a corto plazo y a menudo se deben administrar más de una vez al día durante el estado de leucopenia. Una molécula con una vida media de circulación más larga puede disminuir el número de administraciones necesarias para aliviar la leucopenia y prevenir las infecciones consiguientes. Otro problema con los productos rG-CSF disponibles en la actualidad es la aparición de dolor óseo dependiente de la dosis. Debido a que el dolor óseo es experimentado por los pacientes como un efecto secundario significativo del tratamiento con rG-CSF, sería deseable proporcionar un producto rG-CSF que no causa dolor óseo, ya sea por medio de un producto que inherentemente no tienen este efecto o que es efectivo en una dosis suficientemente pequeña que no causa dolor óseo. Por lo tanto, existe una clara necesidad de mejorar las moléculas recombinantes de G-CSF.

Se han informado variantes de proteínas manipuladas genéticamente de hG-CSF se han reportado (patentes US Nros. 5.581.476, US 5.214.132, US 5.362.853, US 4.904.584 y Riedhaar-Olson et al., Biochemistr y 35: 9034 a 9041, 1996) . La modificación de hG-CSF y otros polipéptidos a fin de introducir al menos una cadena de carbohidrato adicional en comparación con el polipéptido nativo también se ha descrito (patente US N.º 5.218.092) . Además, se han informado y estudiado (ver, por ejemplo, Satake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17: 157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27: 425; patentes US Nros. 5.824.778, US 5.824.784, WO 96/11953, WO 95/21629, y WO 94/20069) .

La unión de polímeros sintéticos al esqueleto del péptido en un intento de mejorar las propiedades farmacocinéticas de la terapéutica con glicoproteína se conoce en la técnica. Un polímero ilustrativo que se ha conjugado con péptidos es poli (etilenglicol) (“PEG”) . Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la patente US. N.º 4.179.337 (Davis et al.) describe polipéptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas al polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Además de una inmunogenicidad reducida, el tiempo de depuración en la circulación se prolonga debido al aumento de tamaño del conjugado- PEG de los polipéptidos en cuestión.

El principal modo de unión de PEG, y sus derivados, a péptidos es una unión no específica a través de un residuo de aminoácido del péptido (ver, por ejemplo, la patente US N.º 4.088.538, patente US N.º 4.496.689, patente US N.º 4.414.147, patente US N º 4.055.635, y PCT WO 87/00056) . Otro modo de fijación de PEG a péptidos es a través de la oxidación no específica de los residuos de glicosilo en un glicopéptido (ver, por ejemplo, WO 94/05332) .

En estos métodos no específicos, se añade poli (etilenglicol) de una manera no específica al azar a los residuos de reactivos en un esqueleto peptídico. Obviamente, la adición aleatoria de moléculas de PEG tiene sus desventajas, como la falta de homogeneidad del producto final, y la posibilidad de reducción en la actividad biológica o enzimática del péptido. Por lo tanto, para la producción de péptidos terapéuticos, una estrategia de derivación que produce la formación de un producto esencialmente homogéneo, fácilmente caracterizable y marcado específicamente es superior. Tales métodos se han desarrollado.

Los agentes terapéuticos de péptidos homogéneos marcados se pueden producir in vitro a través de la acción de las enzimas. A diferencia de los típicos métodos no específicos para la unión de un polímero sintético u otra marca a un péptido, la síntesis basada en enzimas tiene las ventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Dos clases principales de enzimas para usar en la síntesis de péptidos marcados son glicosiltransferasas (por ejemplo, sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) , y glicosidasas. Estas enzimas se pueden utilizar para la unión específica de los azúcares que se pueden modificar posteriormente para comprender un residuo terapéutico. Alternativamente, las glicosiltransferasas y glicosidasas modificadas se pueden usar para transferir directamente los azúcares modificados a un esqueleto peptídico (ver, por ejemplo, la patente US 6.399.336, y la solicitud de patente de publicaciones US 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 y 20040142856) . Los métodos que combinan elementos sintéticos químicos y enzimáticos también son conocidos (ver, por ejemplo, Yamamoto et al. Carbohydr, Res. 305: 415-422 (1998) y la publicación de la solicitud de patente de US 20040137557.

En respuesta a la necesidad de mejorar la terapia con G-CSF, la presente invención proporciona un G-CSF glicopeptilado que es terapéuticamente activo y que tiene parámetros y propiedades farmacocinéticas mejores con respecto a un péptido G-CSF idéntico, o estrechamente análogo, que no es glicopeptilado. Además, la invención proporciona un método para producir de manera rentable y en escala industrial los mejores péptidos de G-CSF de la invención.

Síntesis de la invención Ahora se ha descubierto que la modificación controlada deL factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) con uno o más restos de poli (etilenglicol) proporciona un nuevo derivado de G-CSF con propiedades farmacocinéticas que son mejores con respecto al correspondiente G-CSF nativo (no pegilado) (FIGURA 3) . Por otra parte, la actividad farmacológica del G-CSF glicopeptilado es aproximadamente el mismo que el filgrastim monopegilado disponible en el comercio (Figura 4) .

En una realización ilustrativa, las moléculas de G-CSF “glicopegilado” de la invención se producen por la formación mediada por enzima de un conjugado entre un péptido G-CSF glicosilado o no glicosilado y un resto sacarilo enzimáticamente transferible que incluye un resto (etilenpoliglicol) dentro de su estructura el resto de PEG está unido al resto sacarilo directamente (es decir, a través de un solo grupo formado por la reacción de dos grupos reactivos) o a través de un resto ligador, por ejemplo, alquilo alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, etc. Una estructura ilustrativa de PEG–sacarlo transferible se expone en la FIG. 5.

Por lo... [Seguir leyendo]

1. Un péptido del factor estimulante de colonias de granulocitos que comprende el resto:

donde D es un miembro seleccionado de –OH y R1–L–HN–; G es un miembro seleccionado de R1–L– y –C (O) alquilo (C1–C6) ; R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de:

donde e, f y f son números enteros seleccionados de modo independiente de 1 a 2500; y q, q' y q” son números enteros seleccionados de modo independiente de 1 a 20; y L es un ligador que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido, de modo que cuando D es OH, G es R1–L–, y cuando G es –C (O) alquilo (C1–C6) , D es R1–L–NH–.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde L–R1 tiene la fórmula:

donde a es un número entero de 0 a 20.

3. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde dicho resto tiene la fórmula:

4. El péptido G–CSF de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho resto tiene la fórmula:

5. El péptido G–CSF de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho resto tiene la fórmula:

donde 5 AA es un residuo de aminoácido de dicho péptido.

6. El péptido de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicho residuo de aminoácido es serina o treonina.

7. El péptido de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

8. El péptido de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicho residuo de aminoácido es treonina en la posición 133 10 de la SEQ ID NO: 1.

9. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

10. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende un resto de la fórmula:

donde a, b, c, d, i, r, s, t, y u son números enteros seleccionados de modo independiente de 0 y 1; q es 1; e, f, g, y h son miembros seleccionados de modo independiente de los números enteros de 0 a 6; j, k, 1, y m son miembros seleccionados de modo independiente de los números enteros de 0 y 100; v, w, x, e y se seleccionan de modo independiente de 0 y 1, y al menos uno de v, w, x e y es 1;

AA es un residuo de aminoácido de dicho péptido; Sia– (R) es un resto de la fórmula:

11. El péptido de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho residuo de aminoácido es un residuo de asparagina.

12. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde dicho péptido es el péptido bioactivo del factor estimulante de colonias de granulocitos.

13. Un método de obtener un conjugado del péptido G–CSF que comprende el resto:

donde D es un miembro seleccionado de –OH y R1–L–HN–, G es un miembro seleccionado de R1–L– y –C (O) alquilo (C1–C6) ; R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de:

donde e, f y f' son números enteros seleccionados de modo independiente de 1 a 2500; y q, q' y q” son números enteros seleccionados de modo independiente de 1 a 20; y L es un ligador que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo

sustituido o no sustituido, de modo que cuando D es OH, G es R1-L y cuando G es – (O) alquilo (C1–C6) , D es R1–L–NH–, dicho método comprende:

(a) poner en contacto un sustrato de péptido G–CSF con un resto dador de PEG–ácido siálico que tiene la fórmula:

y una enzima que transfiere dicho PEG–ácido siálico sobre un residuo aminoácido o glicosilo de dicho péptido G– CSF, en las condiciones apropiadas para la transferencia.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde L–R1 tiene la fórmula:

donde a es un número entero de 0 a 20.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14, que además comprende, antes de la etapa (a) : 5 (b) expresar dicho péptido del factor estimulante de colonias de granulocitos sustrato en un huésped adecuado.

16. El método de la reivindicación 15, donde dicho huésped se selecciona de una célula de insecto y una célula de mamífero.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que además comprende formular el péptido en una formulación farmacéutica.

18. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la fabricación de un medicamento para estimular la producción de leucocitos inflamatorios en un mamífero.

19. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la fabricación de un medicamento para tratar una infección.

20. Una formulación farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

21. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso terapéutico.