Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 11

Expresión mejorada de la proteína insecticida Cry3B en platas.

1.1 Campo de la invención

La presente invención divulga plantas transgénicas que expresan niveles sustancialmente mayores de la b-endotoxina de Bacillus thuringiensis que controla los insectos. Se describen procedimientos para obtener dichas plantas y composiciones, y procedimientos para usar dichas plantas y composiciones.

También se divulgan casetes polinucleotídicos mejorados que contienen secuencias codificantes de proteínas preferidas que confieren los niveles sustancialmente mayores de b-endotoxinas que controlan los insectos. Las realizaciones preferidas de la invención proporcionan sorprendentemente niveles hasta diez veces mayores de la proteína que controla los insectos con relación a los niveles más elevados obtenidos usando composiciones anteriores. En particular, maíz transgénico que expresa niveles mayores de una proteína diseñada para mostrar toxicidad aumentada hacia plagas de coleópteros da niveles superiores de protección contra insectos y tienen menor probabilidad de soportar el desarrollo de poblaciones de insectos diana que son resistentes a la proteína insecticidamente activa.

1.2 Descripción de la técnica relacionada

Casi todos los cultivos de campo, plantas, y áreas de agricultura comercial son susceptibles al ataque por una o más plagas de insectos. Son particularmente problemáticas las plagas de coleópteros y lepidópteros.

Como los cultivos de interés comercial a menudo son la diana del ataque de los insectos, son deseables procedimientos tolerantes con el medioambiente para controlar o erradicar la infestación con insectos. Esto es particularmente cierto para agricultores, horticultores, cultivadores, y áreas comerciales y residenciales que buscan controlar las poblaciones de insectos usando composiciones ecológicamente respetuosas. Las formulaciones insecticidas tolerantes con el medioambiente más ampliamente usadas desarrolladas en los últimos años han estado compuestas de pesticidas de proteínas microbianas derivadas de la bacteria Bacillus thuringiensis, una bacteria gram-positiva que produce proteínas cristalinas o cuerpos de inclusión que son específicamente tóxicos contra ciertos órdenes y especies de insectos. Se han identificado muchas variedades diferentes de B. thuringiensis que producen una o más proteínas cristalinas insecticidas así como otras proteínas insecticidas que no forman cristales. Las composiciones que incluyen variedades de B. thuringiensis que producen proteínas insecticidas han estado disponibles en el mercado y se han usado como insecticidas medioambientalmente aceptables porque son bastante tóxicas para las plagas de insectos diana específicos, pero son inofensivas para las plantas y para los animales vertebrados e invertebrados. De forma más importante, como estas proteínas de control de insectos tienen que ingerirse por las plagas de insectos diana susceptibles para ejercer sus efectos insecticidas o tóxicos, la aplicación prudente de dichas composiciones proteicas limita o evita miembros de insectos no diana del orden susceptible que también pueden ser susceptibles a la composición a partir de una exposición significativa a las proteínas (por ejemplo, especies de lepidópteros no diana donde se usa una proteína cristalina de B.t. específica para lepidópteros en una formulación insecticida). Además, se ha demostrado que insectos de diversos órdenes carecen totalmente de susceptibilidad a las proteínas insecticidas específicamente dirigidas incluso cuando se ingieren en grandes cantidades.

1.2.1 d-endotoxinas

Las d-endotoxinas se usan para controlar una amplia gama de orugas y escarabajos que comen plantas, así como mosquitos. Estas proteínas, también mencionadas como proteínas cristalinas insecticidas, proteínas cristalinas, y toxinas Bt, representan una gran serie de proteínas insecticidas producidas por B. thuringiensis que son tóxicas después de la ingestión por un insecto huésped susceptible. Durante la década pasada la investigación sobre la estructura y función de las toxinas de B. thuringiensis ha cubierto todas las categorías de toxinas principales, y aunque estas toxinas difieren en la estructura y la función específicas, se asumen similitudes generales en la estructura y la función. Una revisión reciente describe la genética, bioquímica, y biología molecular de la toxinas Bt (Schnepf y col., Bacillus thuringiensis and its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806, 1998). En base al conocimiento acumulado de las toxinas de B. thuringiensis, se ha creado un modo generalizado de acción para las toxinas de B. thuringiensis e incluye: la ingestión por el insecto, la solubilización en el intestino medio del insecto (una combinación de estómago e intestino delgado), la resistencia a las enzimas digestivas a veces con digestión parcial por las proteasas específicas del intestino que catalizan específicamente una escisión en un sitio peptídico dentro de la estructura de la protoxina que "activa" la toxina, la unión de la toxina al borde en cepillo de las células del intestino medio, la formación de un poro en las células del intestino medio del insecto, y la alteración de la homeostasis celular (English y Slatin, 1992).

1.2.2 Genes que codifican proteínas cristalinas

Muchas de las d-endotoxinas están relacionadas en diversos grados por similitudes en sus secuencias de aminoácidos. Históricamente, las proteínas y los genes que las codifican se clasificaron en gran medida en base a su espectro de actividad insecticida. Una revisión por Hofte y Whiteley (1989) analiza los genes y las proteínas que se identificaron en B. thuringiensis antes de 1990, y expone la nomenclatura y el esquema de clasificación que se ha aplicado tradicionalmente a los genes y proteínas de B. thuringiensis. La nomenclatura original aprovechaba el descubrimiento de que las pocas proteínas Bt Cry conocidas en ese momento generalmente pertenecían a una cantidad limitada de clases, donde cada clase representaba proteínas que tenían especificidad por órdenes específicos de insectos. Por ejemplo, los genes cry1 codificaban proteínas Cry1 tóxicas para lepidópteros. Los genes cry2 codificaban proteínas Cry2 que generalmente eran tóxicas tanto para lepidópteros como para dípteros. Los genes cry3 codificaban las proteínas Cry3 tóxicas para coleópteros, mientras que los genes cry4 codificaban proteínas Cry4 con toxicidad específica para dípteros. La nomenclatura ha llegado a ser, durante la pasada década o más bastante confusa con el descubrimiento de clases relacionadas de forma más distante de proteínas Bt insecticidas. Más recientemente, se han adoptado una nomenclatura homogénea y simplificada y una base para las clasificaciones de proteínas Bt y se ha revisado por Schnepf y col. (1998). Schnepf y col. (1998) también proporciona una solución estructural para un cristal Cry 1. Esta nomenclatura simplificada se adoptará en este documento. También se observará en este documento el convenio de identificar los genes Bt con letras en cursiva y en minúscula (por ejemplo, cry1Ab1) y de identificar las proteínas Bt con el primer carácter en mayúscula (por ejemplo, Cry1Ab1).

En base al grado de similitud de secuencia, las proteínas se han clasificado adicionalmente en subfamilias. A las proteínas que parecen estar más estrechamente relacionadas dentro de cada familia se les asigna letras divisionales tales como Cry1A, Cry1 B, Cry1C, etc. Incluso a proteínas más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les da nombres tales como Cry1Ca, Cry1Cb, etc. y proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se denominan con nombres tales como Cry1 Bb1, Cry1 Bb2, etc.

La nomenclatura moderna clasifica sistemáticamente las proteínas Cry en base a la homología de secuencia de aminoácidos en lugar de en las especificidades de insecto diana. El esquema de clasificación para muchas toxinas conocidas, sin incluir variaciones alélicas en las proteínas individuales, se resume en las tablas actualizadas regularmente que pueden obtenerse del Dr. Neil Crickmore en http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Ncil_Crickmorc/Btlindex.html.

1.2.3 Composiciones polipeptídicas bio-insecticidas

La utilidad de las proteínas cristalinas bacterianas como insecticidas se extendido más allá de larvas de lepidópteros y dípteros cuando se informó del primer aislamiento de una variedad de B. thuringiensis tóxica...

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 11.

2. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un péptido expuesto en la SEC ID Nº 12.

3. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

4. El casete de expresión de la reivindicación 3, que comprende del nucleótido 14 al nucleótido 3020 de la SEC ID Nº 21.

5. El casete de expresión de la reivindicación 3, que comprende del nucleótido 25 al nucleótido 3450 de la SEC ID Nº 23.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una célula transformada que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

8. La célula transformada de la reivindicación 7, en la que la célula es una célula vegetal o una célula bacteriana.

9. La célula transformada de la reivindicación 8, en la que la célula vegetal es una célula de maíz.

10. Una planta o semilla de una planta que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

11. Una planta o semilla de una planta de la reivindicación 10, en la que la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

12. La planta o semilla de la planta de la reivindicación 11, en la que la planta es una monocotiledónea.

13. La planta o semilla de la planta de la reivindicación 12, en la que la planta es maíz.

14. Un procedimiento para producir una célula transformada, que comprende introducir el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula, en el que la célula es una célula vegetal o una célula microbiana.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la célula es una célula vegetal.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la célula vegetal es una célula monocotiledónea.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la célula vegetal es una célula de maíz.

18. Un procedimiento para producir una planta de maíz transformada, que comprende las etapas de:

introducir el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula vegetal de maíz;

seleccionar una célula vegetal de maíz transformada; y

regenerar una planta de maíz a partir de la célula vegetal de maíz transformada, en el que la planta de maíz comprende el polinucleótido y/o el casete de expresión.

19. Un procedimiento para controlar la infestación con insectos coleópteros en un campo de plantas de cultivo, que comprende proporcionar al insecto coleóptero una planta transgénica de la que se alimenta el insecto coleóptero, en el que la planta transgénica es la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.